Electron Capture Dissociation in Combination With High Performance Cyclic Ion Mobility Separation for Detailed Protein Studies

Význam tématu

Electron capture dissociation (ECD) v kombinaci s vysokým rozlišením iontové mobility představuje vysoce výkonnou platformu pro detailní analýzu proteinů a peptidů. Tato metoda umožňuje zachování labilech posttranslačních modifikací (PTM), rozlišení izomerů a zvýšení pokrytí sekvence zejména u velkých peptidů a top-down přístupů.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl demonstrovat:

• separaci izomerických fosfopeptidů při rozlišení mobilitního poměru >320 CCS/ΔCCS,
• ECD sekvenování těchto izomerů po mobilitním dělení,
• zvýšení pokrytí a počtu fragmentních iontů v top-down analýze proteinu ubiquitinu pomocí pre-IMS ECD.

Použitá metodika

Analýza zahrnovala dva přístupy:

• Post-mobility ECD: směs izomerických fosfopeptidů byla separována v cyklickém IMS na 25 průchodech (R≈325) a fragmentována po výstupu z IMS, čímž vznikly ne-chimérické spektra s plným pokrytím sekvence.
• Pre-mobility ECD: ionty ubiquitinu 10+ byly nejprve fragmentovány v ECD před IMS a následně rozděleny podle náboje a tvaru, což výrazně snížilo spektrální kongesci a umožnilo vyšší detekci fragmentů.

Použitá instrumentace

• SELECT SERIES™ Cyclic™ IMS Mass Spectrometer (Waters Corporation)
• Quadrupolový čas-of-flight analyzátor s vysokým rozlišením hmoty a mobility
• Volitelná ECD buňka umístěná před nebo za IMS

Hlavní výsledky a diskuse

Separační experiment na izomerických fosfopeptidech RSpYpSRSR a RYpSpSRSR odhalil dva odlišné příchozí časy (208 ms vs 210 ms) při R≈325. Post-mobility ECD poskytlo ne-chimérická spektra s plným pokrytím a jednoznačnou lokalizací fosfosite.

Top-down analýza ubiquitinu ukázala, že pre-mobility ECD v kombinaci s IMS zdvojnásobilo počet detekovaných fragmentních iontů (z 110 na 253) a zvýšilo sekvenční pokrytí z 89 % na 97 %, čímž posílilo redundanci a důvěryhodnost identifikace.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• zachování a lokalizaci PTM (fosforylace, glykosylace) ve fragmentech,
• jednoznačné rozlišení strukturních izomerů,
• výrazné zvýšení pokrytí a počtu fragmentů v top-down proteomice,
• lepší důvěryhodnost dat pro výzkum proteinů a charakterizaci bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší nasazení ECD+IMS v rutinní kvalitativní i kvantitativní analýze bioterapeutik, glykoproteomice a studiu složitých proteomických vzorků. Další rozvoj modulárních IMS platforem a zvyšování rozlišení povede k hlubšímu porozumění funkčních forem proteinu a kompletní charakterizaci druhově variabilních modifikací.

Závěr

Kombinace ECD a cyklické iontové mobility na SELECT SERIES Cyclic IMS Mass Spectrometer nabízí jedinečnou flexibilitu pre- a post-IMS fragmentace, vysokou mobilitní a hmotovou separaci a významně zvyšuje informační obsah proteomických experimentů. Metoda nachází uplatnění jak ve fundamentálním výzkumu, tak v biopharma průmyslu.

Reference

1. Zubarev RA, Kelleher NL, McLafferty FW. Electron Capture Dissociation of Multiply Charged Protein Cations. J Am Chem Soc. 1998;120(13):3265–6.
2. Bakhtiar R, Guan Z. Electron Capture Dissociation Mass Spectrometry in Characterization of Peptides and Proteins. Biotechnol Lett. 2006;28(14):1047–59.
3. Shaw JB et al. Enhanced Top-Down Protein Characterization with Electron Capture Dissociation and Cyclic Ion Mobility Spectrometry. Anal Chem. 2022;94(9):3888–96.
4. Ippoliti S et al. Confident O-glycosylation Site Identification for ENBREL Using ECD on SELECT SERIES Cyclic IMS. Waters App Brief. 2021.
5. Fellers RT et al. ProSight Lite: Graphical Software to Analyze Top-Down Mass Spectrometry Data. Proteomics. 2014;(15):1235–8.