Sequence Mapping of sgRNA by RNase T1 Digestion and LC/Q-TOF Analysis

Význam tématu

Sequencing a ověření sekvence single guide RNA (sgRNA) jsou zásadní pro vývoj a kontrolu kvality CRISPR‑Cas9 aplikací. Přesnost sekvence přímo ovlivňuje cílení endonukleázy Cas9, účinnost editace a bezpečnost výsledného produktu. Metody, které poskytují spolehlivou kontrolu pořadí nukleotidů a modifikací, proto mají vysokou praktickou hodnotu v biotechnologii, vývoji léčiv i akademickém výzkumu.

Cíle a přehled studie / článku

Primárním cílem bylo předvést praktický workflow pro mapování sekvence 100nt dlouhého sgRNA s terminálními 2′‑O‑methyl a fosforothioátovými modifikacemi kombinací enzymatické digestace RNase T1, separace ion‑pair reverzní fází a vysokorozlišovací LC/Q‑TOF analýzy. Studie ověřila integritu intactního molekulárního hmotnostního zjištění a následnou charakterizaci produktů štěpení pro potvrzení pořadí nukleotidů a mapování modifikací.

Použitá metodika a instrumentace

Popis metodiky:

• Vzorek: syntetický 100mer sgRNA obsahující terminální 2′‑O‑methyl nukleotidy a interní fosfodiesterové vazby, s phosphorothioate vazbami na obou koncích.
• Příprava: 1 pmol/µL v 50 mM Tris‑HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5); štěpení RNase T1 (0.2 µL/µg RNA ekvivalent) při 37 °C po dobu 30 min.
• Strategie: nejprve intactní LC/MS pro ověření molekulové hmotnosti; následně RNase T1 digest generující G‑terminované fragmenty a jejich separace a analýza LC/Q‑TOF pro přesné mapování sekvence.

Instrumentace (samostatná sekce podle požadavku):

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC System: vysokorychlostní pumpa, multisampler s termostatem, multicolumn termostat s Quick Connect Bio výměníkem tepla.
• Kolona: Agilent Altura Oligo HPH, 2.1 × 150 mm, 2.7 µm (Ultra Inert povrch pro minimalizaci interakcí oligonukleotidů s kovovými aktivními místy).
• MS: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q‑TOF s Dual Jet Stream ESI;
• Software: Agilent MassHunter a BioConfirm pro akvizici a dekonvoluci spekter.

Klíčové provozní parametry (souhrn):

• Mobilní fáze: A = 15 mM hexylamin + 25 mM HFIP ve vodě; B = acetonitril.
• Flow: 0.3 mL/min; teplota kolony 50 °C; injekce 5 µL.
• MS režim: negativní ionizace, m/z 500–3 000, rychlost snímání 2 spekty/s, fragmentor 175 V, režim Extended Dynamic Range.

Hlavní výsledky a diskuse

Intactní analýza:

• Teoretická průměrná hmotnost sgRNA: 32 367.6992 Da; dekonvoluované experimentally pozorované: 32 367.9478 Da (rozdíl 0.2486 Da), což potvrdilo očekávanou molekulovou hmotnost a integritu.

Výsledky po RNase T1 digestu:

• RNase T1 štěpí převážně na 3′ straně guanosinu a generuje G‑terminované fragmenty vhodné pro mapování.
• Separace na Altura Oligo HPH poskytla dobré rozlišení fragmentů v rozmezí retencí ~4.1–14.3 min; kolona prokázala schopnost rozlišit i blízké izomery a diastereomery modifikovaných fragmentů.
• Bylo identifikováno 17 fragmentů o délce 2–11 nt podle retence a přesné hmotnosti; dekonvoluované monoisotopické hmotnosti pokryly rozmezí ~692–3 490 Da s průměrnou chybu hmotnosti ≤ ±2.38 ppm (polovina <1 ppm).
• Kombinace unikátních a ne‑unikátních přiřazení poskytla 95% pokrytí sekvence (79% unikátně potvrzeno, 16% pomocí neunikátních fragmentů). Zbylých ~5% nebylo detekováno (např. jednonukleotidový Gp měl špatnou retenci a nebyl detekován).
• Terminálně modifikované fragmenty vykázaly rozštěpené špičky způsobené chromatografickým rozdělením fosforothioátových diastereomerů, což demonstrovalo vysokou selektivitu separace kolony.

Diskuse klíčových omezení:

• Některé krátké fragmenty (zejména Gp) mají špatnou retenční charakteristiku a mohou uniknout detekci při daných podmínkách.
• Ne‑unikátní fragmenty omezují schopnost jednoznačného lokalizování vnitřních sekcí bez paralelních digesčních přístupů nebo MS/MS sekvencování.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody:

• Workflow je jednoduchý a rychlý: přímé štěpení RNase T1, krátká inkubace a okamžitá LC/MS analýza.
• Vysoká přesnost hmotnostního určení umožňuje spolehlivé přiřazení fragmentů a potvrzení přítomnosti modifikací (2′‑O‑methyl, fosforothioát).
• Metoda je vhodná pro rutinní QC sgRNA během vývoje a výroby, poskytuje vysoké pokrytí sekvence bez nutnosti kompletního MS/MS sekvencování celého 100meru.

Možné aplikace:

• Kontrola identity a integrity syntetických sgRNA produktů.
• Rychlé potvrzení přítomnosti a lokalizace terminálních modifikací.
• Komplement k jiným analytickým postupům (kapilární elektroforéza, sekvenování) v QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření mapování pomocí paralelních enzymatických digesí (např. RNase A/H) nebo cílených probe‑mediated digests pro zvýšení unikátního pokrytí a redukci nejednoznačných přiřazení.
• Integrace MS/MS dat pro vysoce informativní fragmentaci specifických digesčních produktů a potvrzení pořadí nukleotidů v nejednoznačných sektorech.
• Optimalizace retenčních metod pro zlepšení detekce krátkých G‑terminovaných fragmentů (alternativní ion‑pair činidla, HILIC režimy nebo úprava gradientu).
• Vyšší výkonnost Q‑TOF a Orbitrap systémů, automatizace zpracování dat a pokročilé algoritmy pro de‑novo mapování oligonukleotidů a rozpoznávání modifikací.

Závěr

Popsaný RNase T1 + LC/Q‑TOF workflow ukazuje efektivní a praktický přístup k potvrzení sekvence 100mer sgRNA s terminálními modifikacemi. Kombinace kvalitní chromatografické separace na Altura Oligo HPH a vysoké hmotnostní přesnosti Agilent 6545XT umožnila identifikaci 17 digestních fragmentů a dosažení 95% teoretického sekvenčního pokrytí. Metoda představuje spolehlivý nástroj pro QC a charakterizaci sgRNA, přičemž potenciál pro další zlepšení spočívá v rozšíření enzymových přístupů a implementaci detailnější fragmentační analýzy.

Reference

1. Goyon A., Scott B., et al. Full Sequencing of CRISPR/Cas9 Single Guide RNA (sgRNA) via Parallel Ribonuclease Digestions and Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography–HighResolution Mass Spectrometry Analysis. Anal. Chem. 2021.
2. Gawlig C., Hirschberger R., Hanci G., et al. Full Sequencing of 100mer sgRNA via Tandem Mass Spectrometry by Targeted RNase H Digestion with Customized Probes. Anal. Bioanal. Chem. 2025. DOI: 10.1007/s00216-025-05737-y.
3. Jiang T., Yu N., Kim J., et al. Oligonucleotide Sequence Mapping of Large Therapeutic mRNAs via Parallel Ribonuclease Digestions and LCMS/MS. Anal. Chem. 2019, 91(13), 8500–8506. DOI: 10.1021/acs.analchem.9b01664.