Performance evaluation of a new reversed-phase column for peptide mapping and monitoring of monoclonal antibodies

Význam tématu

Peptidové mapování a monitorování monoklonálních protilátek představuje klíčový nástroj v biofarmaceutické charakterizaci. Umožňuje potvrdit primární strukturu bílkovin, lokalizovat a kvantifikovat post-translační modifikace (deamidace, oxidace, glykosylace), a tím zajistit bezpečnost a účinnost bioterapeutik.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo otestovat nový reverzně-fází kolonu Thermo Scientific Hypersil GOLD Peptide C18 (150 × 2,1 mm, 1,9 µm, 175 Å) při UHPLC-MS/MS peptidovém mapování a UHPLC-UV-MS monitorování tryptických digesátů monoklonálních protilátek (NISTmAb, rituximab, adalimumab). Hodnotila se reprodukovatelnost, chromatografické rozlišení a schopnost separovat hydrofobní i hydrofilní peptidy.

Použitá metodika

Byly využity dvě hlavní workflow:

• UHPLC-MS/MS peptidové mapování: gradient 1–35 % acetonitrilu v 64 min, celkem 115 min, detekce Orbitrap Exploris 240.
• UHPLC-UV-MS peptidové monitorování: gradient 2–35 % acetonitrilu v 21 min, celkem 45 min, detekce ISQ EM single quadrupole MS.

Před analýzou byla provedena kondice kolony se šesti injekcemi BSA digestu jako systémová validační zkouška.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Horizon/Flex UHPLC systém
• Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240 HRAM MS
• Thermo Scientific ISQ EM single quadrupole MS
• Software BioPharma Finder 5.1 a Chromeleon 7.3.2

Hlavní výsledky a diskuse

• Retenční časy vykázaly %RSD 0,04–0,63 a plocha piku %RSD <10 %, splňující kritéria <1 % pro RT a <10 % pro plošný signál.
• Rozlišení deamidovaných forem peptidu PENNYK dosahovalo hodnot 1,4–1,9 pro formu 2 a 2,0–4,3 pro formu 3.
• Mezi šaržemi i mezi koloniemi byla vynikající reprodukovatelnost (%RSD RT ≤0,6 %, plocha piku ≤6,2 %).
• Kolona efektivně separovala jak hydrofilní, tak hydrofobní peptidy a zachovala symetrické tvary píků.

Přínosy a praktické využití metody

• Spolehlivá a rychlá analýza peptidových map s vysokou přesností a robustností.
• Jednotné výsledky mezi šaržemi kolony minimalizují nutnost časté kalibrace.
• Vhodné pro rutinní QC a charakterizaci bioterapeutik v GMP prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace stacionární fáze pro zkrácení analýz a zvýšení rozlišení.
• Integrace s multi-attribute metodami (MAM) a automatizace datové analýzy pomocí AI.
• Vývoj materiálů odolnějších vůči vysokým tlakovým podmínkám pro ultrarychlou chromatografii.

Závěr

Thermo Scientific Hypersil GOLD Peptide C18 kolona prokázala vynikající výkon při peptidovém mapování a monitorování monoklonálních protilátek. Díky vysoké přesnosti, reprodukovatelnosti a schopnosti rozlišit klíčové PTM představuje spolehlivý nástroj pro biopharma aplikace.

Reference

1. Millán-Martín S. et al., Comprehensive multi-attribute method workflow for biotherapeutic characterization and current good manufacturing practices testing. Nat. Protoc. 2023, 18(4), 1056–1089.
2. Thermo Fisher Scientific Application Note 002735, Performance comparison of reversed-phase C18 columns for peptide mapping of monoclonal antibodies, 2024.
3. Thermo Fisher Scientific Application Note 002776, Hypersil GOLD Peptide column for reliable monitoring of glycopeptide variants in monoclonal antibodies by LC-UV-MS analysis, 2024.
4. EDQM, Ph. Eur. Commission adopts harmonised general chapter 2.2.46. Chromatographic separation techniques.