Hypersil GOLD Peptide column for reliable monitoring of glycopeptide variants in monoclonal antibodies by LC-UV-MS analysis

Význam tématu

Monitorování glykosylačních variant monoklonálních protilátek je klíčové pro hodnocení kvality a účinnosti bioterapeutik. Přesná kvantifikace glykopeptidů umožňuje sledovat posttranslační modifikace a zajišťuje konzistentní výrobní proces.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo demonstrovat výhody použití C18 kolony Hypersil GOLD Peptide pro LC-UV-SQMS analýzu tryptického digestu adalimumabu. Studie se zaměřila na opakovatelnost a reprodukovatelnost měření glykosylačních variant.

Použitá metodika

Vzorek adalimumabu byl redukován TCEP a následně digesován pomocí SMART Digest Trypsin kitu při nízkém pH. Digesty byly zastaveny formiokyselinou a přeneseny do HPLC vialek. Chromatografie probíhala na kolóně Hypersil GOLD Peptide 150×2.1 mm, 1.9 μm s mobilní fází voda + 0.1 % formiokyselina (A) a acetonitril + 0.1 % formiokyselina (B) při gradientu 2–90 % B během 45 min při 50 °C. Detekce UV na 214 nm (20 Hz) a MS v režimu SIM na single quadrupole spektrometru ISQ EM v pozitivním módu HESI.

Použitá instrumentace

• Vanquish Flex UHPLC se split samplerem, binary pumpou a column compartmentem
• Variable Wavelength Detector F pro UV detekci
• ISQ EM single quadrupole mass spektrometr s HESI ionizací
• SMART Digest Trypsin Kit (non-magnetic, nízké pH) a Bond-Breaker TCEP roztok

Hlavní výsledky a diskuse

Kolony prokázaly vynikající šarže-k-šarži reprodukovatelnost: retenční časy RSD ≤ 0.6 %, šířka píků (50 %) RSD ≤ 3.9 % a plocha píků RSD ≤ 6.2 %. Relativní zastoupení glykopeptidů A2G0F, A2G1F a A2G2F bylo mezi šaržemi kvantifikováno s RSD ≤ 5.2 % a mezi kolónami s RSD ≤ 3.0 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká reproducibilita vhodná pro rutinní QC analýzy
• Ostré symetrické píky zajišťují vyšší citlivost a nízké LOQ
• Spolehlivé sledování posttranslačních modifikací mAb

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit na další posttranslační modifikace a varianty monoklonálních protilátek. Integrace s vysokorychlostními systémy a pokročilou datovou analýzou umožní automatizaci QC a zkrácení vývojového cyklu bioterapeutik.

Závěr

Hypersil GOLD Peptide kolona prokázala vynikající výkon při LC-UV-SQMS monitorování glykosylačních variant v monoklonálních protilátkách. Metoda nabízí vysokou reprodukovatelnost, citlivost a rutinní použitelnost v bioprodukční a výzkumné praxi.

Reference

1. Gucinski AC, Boyne MT Evaluation of intact mass spectrometry for the quantitative analysis of protein therapeutics Analytical Chemistry 2012 84(18) 8045–8051
2. Jefferis R Posttranslational modifications and the immunogenicity of biotherapeutics Journal of Immunology Research 2016 1–15