MAPPING PHOSPHORYLATION OF PEPTIDE BIOMARKERS CORRESPONDING WITH GLIOBLASTOMA TUMOURS USING DDA AND A NOVEL MRT MASS SPECTROMETER

Význam tématu

Glioblastom představuje vysoce maligní nádor mozku s omezenými léčebnými možnostmi a nízkou pětiletou přežitostí pod 10 %. Fosforylace jako klíčová posttranslační modifikace reguluje aktivitu enzymů a signálních drah, proto je podrobná analýza fosfoproteomu zásadní pro pochopení patogeneze tumoru a vývoj nových terapií.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo zmapovat fosforylaci peptidů v lidských buněčných liniích glioblastomu před a po léčbě terapií vyčerpáním argininu (ADI-PEG20). Pro tento účel byl navržen workflow založený na selektivním obohacení fosfopeptidů a analýze pomocí datově závislého záznamu (DDA) na vysoce rozlišeném hmotnostním spektrometru Xevo MRT MS.

Použitá metodika a instrumentace

• Buňěčné kultury čtyř glioblastomových linií a in vitro terapie ADI-PEG20 pro odstranění argininu.
• Lýza buněk v prostředí proteázových a fosfatázových inhibitorů, redukce, alkylace a tryptická digestce.
• Obohacení fosfopeptidů pomocí Fe(III)-NTA spin sloupců.
• Chromatografická separace na systému ACQUITY Premier UPLC s CSH kolonou (2,1×100 mm, 45 °C) a gradientem 1–35 % MeCN za 30 minut.
• Analýza na Xevo MRT MS ve DDA režimu, sběr top 15 nejintenzivnějších iontů, rychlost skenování 20 Hz a rozlišení >70 000 FWHM.

Hlavní výsledky a diskuse

• Úspěšné obohacení a detekce fosfopeptidů s vysokou účinností a minimálním nevázaným pozadím.
• Identifikace více než 320 proteinů s lokalizací fosforylačních míst díky vynikajícím MS/MS spektrům.
• Analýza signálních drah odhalila změny v regulaci cytoskeletu, neurologických funkcích a translačních procesech mezi ošetřenými a neošetřenými buňkami.
• Terapeutická deplece argininu vyvolala výrazné odlišnosti v aktivaci kinázových a dalších regulativních drah.

Přínosy a praktické využití metody

• Workflow poskytuje robustní platformu pro detailní mapování fosfoproteomu i nízkoabundantních peptidů.
• Vysoké rozlišení a přesnost hmotnostního spektrometru umožňuje jednoznačné přiřazení lokalizace modifikací.
• Metoda je vhodná pro výzkum mechanismů léčebných zásahů a objev cílových biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s datově nezávislou akvizicí (DIA) pro zvýšení hloubky proteomického pokrytí.
• Rozšíření na další posttranslační modifikace a kvantitativní analýzy.
• Uplatnění v klinických studiích a personalizované medicíně.
• Kombinace s pokročilou bioinformatickou sítovou analýzou pro cílené objevování léků.

Závěr

Studie demonstrovala efektivní workflow pro analýzu fosforylace v buňkách glioblastomu pomocí DDA a Xevo MRT MS. Metoda vykazuje vysokou citlivost, rozlišení i spolehlivost při lokalizaci modifikací a otevírá cestu pro další výzkum terapeutických strategií.

Reference

1. Poon M.T.C. et al. Sci Rep. 2020;10:11622.
2. Qin A. et al. Neuro-Oncology Advances. 2021;3(1):vdab133.
3. Srinivasan A. et al. J Proteome Res. 2022;21(8):1789-1799.
4. Hajji N. et al. J Clin Invest. 2022;132(6):JCI142137.