Mapping phosphorylation of peptide biomarkers corresponding with glioblastoma tumours using data-dependent acquisition and multi-reflecting time-of-flight mass spectrometry

Význam tématu

Mapping fosforylace peptidových biomarkerů u glioblastomu přináší cenné poznatky pro vývoj cílených terapií a porozumění regulačním procesům v nádorových buňkách. Fosforylace, jako klíčová posttranslační modifikace, ovlivňuje aktivitu kináz a dalších signálních molekul, což je v kontextu agresivního průběhu glioblastomu zásadní pro identifikaci nových terapeutických cílů a prognostických markerů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo optimalizovat LC-MS workflow s využitím Xevo MRT hmotnostního spektrometru pro kvalitativní a kvantitativní analýzu fosforylovaných peptidů z kultur lidských glioblastomových buněk. Experiment se zaměřil na porovnání fosfoproteomů buněk před a po aplikaci argininové deprivace (ADI-PEG20), se zdůrazněním spolehlivé lokalizace fosforylačních míst.

Metodika

Enrichování fosfopeptidů:

• Ošetření čtyř primárních glioblastomových linií ADI-PEG20 pro degradaci argininu.
• Lyze buněk s proteázovými a fosfatázovými inhibitory, redukce, alkylace a tryptická digesce.
• Selektivní obohacení pomocí Fe(III)-NTA spin sloupců.

Analytické podmínky LC-MS:

• Separace na ACQUITY Premier Peptide CSH kolóně (2.1×100 mm) při 45 °C, gradient 1–35 % B za 30 minut.
• Data dependent acquisition (DDA) režim volby 15 nejsilnějších iontů za sken, rychlost MS1 10 Hz, MS/MS 4 Hz.
• Rozpoznání náboje 2+ až 4+, dynamické vyloučení po 30 s, 500 mDa okno, kolizní energie s rampováním podle náboje.

Použitá instrumentace

• ACQUITY Premier Chromatography System s ACQUITY Premier Peptide CSH kolónou.
• Xevo MRT Mass Spectrometer s multi-reflecting ToF pro rozlišení až 100 000 FWHM a vysokou hmotnostní přesnost (<500 ppb).

Hlavní výsledky a diskuse

Enrichment fosfopeptidů ve spojení s DDA umožnil identifikaci přes 320 fosfoproteinů. Umožněno bylo spolehlivé mapování místa fosforylace díky včasné detekci neutralního úbytku 98 Da. MetaCore analýza prokázala zapojení signálních cest spojených s neurologickými poruchami, regulací cytoskeletu a translací. Porovnání ošetřených a neošetřených vzorků odhalilo změny v kinázových drahách a regulačních sítích jako odpověď na metabolickou terapii.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoce selektivní odchyt nízko abundantních fosfopeptidů.
• Rychlá a přesná lokalizace fosforylačních míst i u labilních modifikací.
• Možnost kvantitativního sledování dopadů léčebných zásahů.
• Široké využití v proteomice, farmaceutickém výzkumu a biomarkerové identifikaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Pokračující vývoj metod pro hloubkovou analýzu fosfoproteomů může zahrnovat:

• Integraci s data-independent acquisition (DIA) pro komplexní profilování.
• Rozšíření na další posttranslační modifikace a vzorky z klinických biopsií.
• Automatizaci workflow pro vyšší propustnost a reprodukovatelnost.
• Kombinaci s bioinformatickými nástroji pro prediktivní modelování terapeutických odpovědí.

Závěr

Implementovaná strategie obohacení a analýzy pomocí Xevo MRT MS nabídla robustní platformu pro detailní mapování fosfoproteomu glioblastomových buněk. Workflow prokázalo vysoké rozlišení, přesnost i rychlost skenování, což bylo zásadní pro identifikaci fosforylačních míst a hodnocení účinku metabolické terapie.

Reference

1. Poon M.T.C. et al. Sci Rep. 2020;10:11622.
2. Qin A. et al. Neuro-Oncology Advances. 2021;3(1):vdab133.
3. Srinivasan A. et al. J Proteome Res. 2022;21(8):1789–1799.
4. Hajji N. et al. J Clin Invest. 2022;132(6):JCI142137.