A Novel, Automated, and Highly Selective Phosphopeptide Enrichment for Phosphopeptide Identification and Phosphosite Localization

Význam tématu

Phosphopeptidová analýza je klíčová pro studium buněčných signalizačních drah a posttranslačních modifikací. Enrichování fosforylovaných peptidů z komplexních vzorků zvyšuje citlivost a selektivitu LC/MS analýzy, minimalizuje potlačení signálu a umožňuje přesné určení lokalizace fosfosite.

Cíle a přehled studie / článku

Studie v rámci HUPO Human Proteome Project řešila automatizované obohacení fosfopeptidů a jejich identifikaci v čistém standardu i v matrici kvasnicového lyzátu. Cílem bylo porovnat reprodukovatelnost, selektivitu a schopnost lokalizovat fosforylační místa pomocí kombinace CID a ECD analytických postupů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky „Phosphopeptide“ a „Phosphopeptide-Yeast“ se připravily na Agilent AssayMAP Bravo platformě s Fe(III)-NTA cartridgy pro obohacení a C18 cartridgy pro čistění. Peptidy byly separovány na Agilent 1290 Infinity II LC v nanoflow režimu přeměněném pomocí Nanodapteru a detekovány na Agilent 6550 iFunnel Q-TOF MS. Identifikace probíhala metodou data-dependent acquisition (top 15 DDA, CID), lokalizace fosfosite byla ověřována vlastní EMS ECD buňkou, kvantifikace relativní ze špičkových MS1 signálů pomocí Skyline, Spectrum Mill a Byonic.

Hlavní výsledky a diskuse

V čistém standardu bylo při triplikátech DDA identifikováno 437 unikátních peptidů, z toho 294 fosfopeptidů. Vyhodnocení selektivity ukázalo ~67 % fosfopeptidů z celkového počtu. ECD analýza potvrdila lokalizaci 124 fosforylačních míst ve 94 sekvencích. V matrici kvasnic bylo po obohacení zjištěno 287 peptidů a 264 fosfopeptidů, selektivita dosáhla ~92 %. Z 94 standardních fosfopeptidů bylo 93 znovu detekováno.

Přínosy a praktické využití metody

• Plně automatizované obohacení minimalizuje variabilitu manuálních kroků.
• Vysoká kapacita Fe(III)-NTA cartridgů umožňuje zpracovat i malé objemy vzorku.
• Kombinace CID a ECD přináší spolehlivou lokalizaci fosfosite včetně multiplásťových peptidů.
• Relativní kvantifikace fosforylace na úrovni jednotlivých pozic podporuje studium dynamiky PTM.

Budoucí trendy a možnosti využití

Předpokládá se rozšíření platformy o vyšší multiplexaci, integraci v rámci proteomických workflow a využití umělé inteligence pro interpretaci ECD spekter. Další vývoj směřuje k miniaturizaci kartridgí a optimalizaci pro vysoce kyselé či zásadité matrice, což podpoří výzkum signálních drah v klinických a farmaceutických aplikacích.

Závěr

Agilent AssayMAP Bravo s Fe(III)-NTA cartridgy v kombinaci s LC/Q-TOF a EMS ECD poskytuje vysoce selektivní, automatizované a reprodukovatelné obohacení fosfopeptidů. Metoda dosahuje vysoké identifikace a přesné lokalizace fosfosite, což je nezbytné pro výzkum fosfoproteomiky.

Reference

• Russell J. D., Murphy S. Agilent AssayMAP Bravo Technology Enables Reproducible Automated Phosphopeptide Enrichment Using High-Capacity Fe(III)-NTA Cartridges, Agilent Technologies Application Note 2016.
• Wu S., Wu L. Human Breast Cancer Cell Line Phosphoproteome Revealed by an Automated and Highly Selective Enrichment Workflow, Agilent Technologies Application Note 2018.
• Hsiao J. J. et al. Improved LC/MS Methods for the Analysis of Metal-Sensitive Analytes Using Medronic Acid as a Mobile Phase Additive, Anal. Chem. 2018, 90(15), 9457–9464.