QUANTITATIVE NON-ANTIBODY AFFINITY LC-MS/MS ANALYSIS OF GLYCOPROTEINS

Význam tématu

Analytika glykoproteinů hraje klíčovou roli v diagnostice onkologických a virových markerů. Bottom-up LC-MS přístupy čelí proměnlivé glykosylaci, nesnadné digesci a nízkým koncentracím analyzovaných proteinů v komplexních vzorcích.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl optimalizovat kombinovanou deglycosylaci a proteolytickou digesci glykoproteinů a porovnat efektivitu afinitního obohacení pomocí protilátek, Affimerů a molekulárně imprintovaných polymerů. Modelovými proteiny byly karcinoembryonální antigen CEA, CA-125 a SARS-CoV-2 Spike protein.

Použitá metodika a instrumentace

Metodu tvoří následující kroky: afinitní obohacení na magnetických nosičích, denaturace, redukce a alkylace přímo na povrchu nosiče a následná společná inkubace s PNGase F a trypsinem pro odstraňování N-glykánů a proteolytickou digesci. Po eluci byla provedena chromatograficko-hmotnostní analýza v režimu MRM.

• Afinitní reagencie: komerční protilátky, Affimery, molekulárně imprintované polymery (MIP)
• Digesce: trypsin a PNGase F aplikované simultánně
• Detekce: LC-MS/MS v režimu Multiple Reaction Monitoring na přístroji Xevo TQ-XS spojeném s ACQUITY UPLC I-Class
• Podpůrné techniky: ELISA pro předběžnou validaci, SDS-PAGE pro kontrolu čistoty

Hlavní výsledky a diskuse

• Zapojení PNGase F do protokolu zvýšilo signál CEA více než 100000× ve srovnání s digescí bez odstraňování glykánů.
• Pro CA-125 byla pozorována 10–50násobná citlivostní zlepšení; kvůli nejednoznačné epitopové struktuře však nebylo afinitní obohacení dále rozpracováno.
• Affimerové a protilátkové sondy poskytly srovnatelnou afinitní účinnost, avšak vyžadovaly individuální optimalizaci podmínek a vykazovaly mírné nespecifické vazby.
• MIP vybrané pro SARS-CoV-2 Spike prokázaly specifickou a kvantitativní odezvu; deglycosylace neměla výrazný vliv vzhledem k nízké glykosylaci standardního proteinu.
• Zavedení PNGase F do přípravy vzorku nezpůsobilo žádné negativní vedlejší reakce a bylo kompatibilní s automatizovanýmimagnetickými protokoly.

Přínosy a praktické využití metody

Vylepšený protokol nabízí výrazné navýšení citlivosti a spolehlivosti kvantitativní analýzy glykoproteinů v klinicky relevantních koncentracích. Alternativní afinitní reagencie jako Affimery a MIP rozšiřují možnosti výběru sond a mohou nahradit či doplnit klasické protilátky.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Systematická charakterizace epitopů CA-125 pro přesné afinitní cílení
• Rozšíření platformy MIP a Affimer pro další glykoproteiny a biomarkery
• Automatizace celého workflow pro vysokopropustné klinické aplikace
• Vývoj nových obohacovacích povrchů minimalizujících nespecifické vazby

Závěr

Optimalizace kombinované deglycosylace a proteolytické digesce značně zvyšuje výkon bottom-up LC-MS/MS analýzy glykoproteinů. Affimery a MIP reagencie se osvědčily jako efektivní alternativy k tradičním protilátkám v kvantitativních aplikacích.

Reference

1. Shamsuddin SH Jayne DG Tomlinson DC McPherson MJ Millner PA Selection and characterisation of Affimers specific for CEA recognition Sci Rep 2021 11 744
2. Bossi A Bonini F Turner AP Piletsky SA Molecularly imprinted polymers for the recognition of proteins the state of the art Biosens Bioelectron 2007 22 1131-1137
3. Van Puyvelde J et al Cov2MS An Automated and Quantitative Matrix-Independent Assay for Mass Spectrometric Measurement of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein Anal Chem 2022 94 17379-17387
4. Waters Corporation Xevo ACQUITY UPLC I-Class UPLC and MS trademarks Waters