QUANTITATIVE EVALUATION OF AFFIMER AND MOLECULAR IMPRINTED POLYMER AFFINITY GLYCOPROTEINS ANALYSIS BY MULTIPLE REACTION MONITORING LC-MS/MS

Význam tématu

Analýza specifických glykoproteinů hraje klíčovou roli v klinickém výzkumu nádorových a virových biomarkerů. Detailní kvantifikace glykoizoforem a jejich posttranslačních modifikací přináší nové možnosti pro diagnostiku a monitoring onemocnění. Kombinace specifických afinitních ligandů (Affimer® a MIP) s vysoce citlivými LC-MS/MS MRM metodami umožňuje překonat obtíže spojené s heterogenní glykosylací, nízkými hladinami analyzovaných proteinů a interferencemi v komplexních biologických matricích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat výkonnost affinitních sorbentů založených na rekombinantních Affimerech a molekulárně imprinted polymeru (MIP) vůči tradičním protilátkám při obohacení a kvantifikaci tří modelových glykoproteinů: karcinoembryonální antigenu (CEA), CA-125 a S-proteinu SARS-CoV-2. Studie zahrnuje vývoj, optimalizaci a semi-automatizaci protokolů afinitního obohacení a následné MRM detekce pomocí LC-MS/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala:

• Výrobu a konjugaci Affimer® a MIP reagentů na pevnou fázi (skleněné kuličky) pomocí biotin-streptavidin a aminoskupinového vázání.
• On-bead kombinovanou deglykozylaci (PNGase F) a proteolytickou štěpení trypsinem v jednom kroku.
• Denaturaci a redukci proteinu přímo na sorbentu pomocí RapiGest SF, dithiothreitol (DTT) a iodoacetamidu (IAA).
• Chromatografii na ACQUITY UPLC I-Class PLUS systému a detekci na Xevo TQ-XS MS v režimu MRM.
• Zpracování dat softwarem TargetLynx a otevřeným Skyline.

Hlavní výsledky a diskuse

Pro CEA přidání PNGase F před tryptickým štěpením zvýšilo signál v LC-MS o více než 10^5násobek. U CA-125 byl pozorován 10–50násobný nárůst signálu, avšak afinitní obohacení nebylo dále rozvíjeno kvůli nespecifičnostem v identitě epitopů. Pro S-protein SARS-CoV-2 MIP sorbenty dosáhly kvantitativní vazby a analytického odezvy s lineární odezvou v širokém rozmezí koncentrací. Nevýznamný vliv glykosylace rekombinantních standardů potvrdil, že deglykozylace výrazně zvyšuje signál pouze u vysoce glykosylovaných biomarkerů. Byly identifikovány a optimalizovány proteotypické peptidy pro MRM sledování každého analyzovaného proteinu.

Přínosy a praktické využití metody

Afinitní obohacení s Affimery a MIP významně zvýšilo citlivost a selektivitu analýzy glykoproteinů v komplexních matricích, což otevírá cestu k nízké úrovni detekce v klinických vzorcích. Metoda je kompatibilní s existujícími automatizovanými workflow a umožňuje flexibilní offline i online integraci do LC-MS/MS analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování zahrnuje plnou automatizaci afinitní přípravy vzorku, integraci do 2D-LC systémů a rozšíření na multiplexní detekci celé řady glykoproteinových markerů. MIP a Affimer® technologie lze přizpůsobit novým cílovým proteinům, včetně dalších virových antigenů a onkologických markerů.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace specifických affinitních ligandů s optimalizovaným deglykozylačně-proteolytickým štěpením a citlivou MRM detekcí zajišťuje vysokou selektivitu a nízkou mez detekce pro glykoproteinové biomarkery. Affimery i MIP sorbenty představují robustní alternativu ke klasickým protilátkám a rozšiřují možnosti cílené proteomiky v oblasti klinické analytiky.

Reference

1. Shamsuddin SH, Jayne DG, Tomlinson DC, McPherson MJ, Millner PA. Selection and characterisation of Affimers specific for CEA recognition. Sci Rep. 2021;11(1):744.
2. Bossi A, Bonini F, Turner AP, Piletsky SA. Molecularly imprinted polymers for the recognition of proteins: the state of the art. Biosens Bioelectron. 2007;22(6):1131–1137.
3. Van Puyvelde J et al. Cov2MS: An Automated and Quantitative Matrix-Independent Assay for Mass Spectrometric Measurement of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein. Anal Chem. 2022;94(50):17379–17387.
4. The Native Antigen Company. SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein S1. [online].
5. MacLean B et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 2010;26(7):966–968.