Initial Development of SARS-CoV-2 Antigen Assay Using BAMS Technology and MALDI-TOF

Význam tématu

Rychlá a citlivá detekce antigenu SARS-CoV-2 je zásadní pro včasnou diagnostiku infekce a omezování přenosu. Využití hmotnostní spektrometrie v kombinaci s afinitními sorbenty představuje inovativní přístup umožňující přímé zachycení a analýzu virového proteinu bez potřeby amplifikace nukleových kyselin.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout assay pro detekci spike glykoproteinu S1 koronaviru SARS-CoV-2 na platformě BAMS (Bead Assisted Mass Spectrometry) s detekcí pomocí MALDI-TOF MS. Studie zahrnovala:

• Imobilizaci specifických Affimerů na magnetické perličky.
• Afinitní zachycení rekombinantního S1 proteinu.
• Detekci intactního proteinu i jeho tryptického digestu.
• Optimalizaci metody na přístrojích rapifleX TOF/TOF a microflex.

Použitá metodika a instrumentace

Afinitní zachycení probíhalo v pufru PBS s blokováním BSA, perličky se promyly a následně eluoval intactní S1 protein matricí DHAP či tryptický digest matricí CHCA. Spectrometrie:

• Bruker rapifleX TOF/TOF s 10 kHz smartbeam 3D laserem (lineární a reflektorový režim).
• Bruker microflex smart LS se smartbeam laserem 200 Hz (lineární režim).
• Bruker microflex LT s 60 Hz dusíkovým laserem (lineární režim).
• Software flexAnalysis, BioPharma Compass a BioTools pro zpracování spekter a sekvenční pokrytí.

Hlavní výsledky a diskuse

Detekce intactního S1 proteinu:

• Na rapifleX zachycen masivní signál [M+H]+ s glycoformami v rozsahu 10–300 kDa.
• Na microflex smart LS detekce intactního proteinu i z jednoho perličky s menší intenzitou, ale srozumitelným profilem.

Trypsinový digest:

• Butterfly plot zachycující rozdíly mezi digestem S1 proteinu a Affimer kontrolou.
• MS sekvenční pokrytí 65 % a MS/MS 22,5 % při použití eluátu z pěti perliček.
• Reprezentativní MALDI-TOF/TOF spektra ukázala úplné série y-iontů a významnou část b-iontů.
• Microflex instrumenty poskytly nižší pokrytí proti rapifleX, avšak stále vhodné pro klinické nasazení.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje cílenou a citlivou analýzu virového antigenu bez PCR, s možností přímé detekce intactního proteinu či na úrovni peptidů. Platforma BAMS je adaptovatelná pro různé proteiny díky výměně afinity reagencií. Přenos na microflex usnadní implementaci v klinických laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zvýšení citlivosti optimalizací digesce a matrice.
• Multiplexní detekce různých virových proteinů v jednom běhu.
• Integrace do automatizovaných workflow pro vysokopropustný screening.
• Rozšíření platformy na detekci biomarkerů dalších patogenů či onkologických markerů.

Závěr

Vyvinutý BAMS-MALDI-TOF assay pro SARS-CoV-2 S1 glykoprotein prokázal schopnost selektivně zachytit a detekovat virový antigen v intactní formě i po tryptickém digestu. Transfer na mikroflex platformu otevírá cestu k praktickému využití v klinických laboratořích a masovém testování.

Reference

• [1] Carter LJ et al. (2020). ACS Cent. Sci. 6: 591–605.
• [2] Hamza GM et al. (2020). Int. J. Mol. Sci. 21: 2016.
• [3] Bergo VB (2017). U.S. Patent 9618520.
• [4] Adeptrix Corporation Store: Recombinant SARS-CoV-2 S1 Glycoprotein.