Comprehending COVID-19: Maximizing LC-MS Detection Dynamic Range for Multiple Reaction Monitoring Based SARS-CoV-2 Analysis

Význam tématu

Detekce proteinů SARS-CoV-2 v klinických vzorcích pomocí cílené LC-MS proteomiky představuje důležitou alternativu ke standardním PCR metodám. Umožňuje přímou identifikaci virových antigenů v nosních výtěrech a podporuje široké využití v epidemiologickém sledování, výzkumu a v klinicko-diagnostickém vývoji nových postupů.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje optimalizaci metody Multiple Reaction Monitoring (MRM) pro kvantifikaci dvou klíčových virových proteinů – Spike glykoproteinu a Nucleoproteinu – v nosofaryngeálních výtěrech uchovávaných v Universal Transport Medium (UTM). Klíčovým cílem bylo rozšířit dynamický rozsah měření, zajistit linearitu na pěti destratifikačních úrovních a udržet vysokou reprodukovatelnost měření.

Použitá metodika

Vzorky were digested proteolyticky a doředěny rekombinantními proteiny SARS-CoV-2 ve výtěrové matrici UTM. Pro kvantifikaci byly zvoleny surrogate peptidy, každý monitorovaný pomocí alespoň dvou MRM přechodů. Chromatografická separace probíhala gradientem trvajícím 5,5 min v rámci celkového cyklu <9 min.

Použitá instrumentace

• LC systém: ACQUITY UPLC I-Class PLUS, kolona PREMIER Peptide BEH C18 (2,1×50 mm, 1,7 µm)
• MS systém: Xevo TQ-XS Tandem Quadrupole, ionizace ESI+ v režimu MRM
• Spotřební materiál: MaxPeak HPS vials, QuanRecovery vials
• Software: MassLynx, TargetLynx, Skyline

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace spotřebních komponent a složení resuspension solventu vedla k nárůstu signálu až o ~55 %. Chromatografické okno 5,5 min umožnilo šířku špiček 4–6 s a udržení vysokého počtu datových bodů. Linearity pro peptidy SFIEDLLFNK (Spike) a NPANNAAIVLQLPQGTTLPK (NCAP) dosáhla R2 ≥ 0,998 na pěti úrovních spike (5–500 ng), s rezidui pod 15 %. Detekční limit byl ovlivněn matricí, v čistém roztoku byl nižší než v UTM.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý throughput: <9 min na vzorek
• Široký dynamický rozsah kvantifikace
• Vysoká reprodukovatelnost (%CV pod robustními podmínkami)
• Možnost nasazení v klinických, výzkumných a průmyslových laboratořích

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se očekává v oblasti efektivnějších pre-analytických čistících postupů, alternativních odběrových médií k UTM a rozšíření MRM panelu pro další virové či bakteriální patogeny. Kombinace s automatizovanými platformami může zvýšit škálovatelnost a dostupnost metody.

Závěr

Optimalizovaná MRM metoda na platformě UPLC I-Class PLUS a Xevo TQ-XS prokázala robustní linearitu, vysoký dynamický rozsah a krátký analytický cyklus. Cílená proteomika SARS-CoV-2 je vhodným doplňkem stávajících molekulárních přístupů a nabízí přímou kvantifikaci virových proteinů v klinických vzorcích.

Reference

1. Parks JM, Smith JC. How to Discover Antiviral Drugs Quickly. N Engl J Med. 2020;382(23):2261–2264.
2. Bezstarosti K et al. Targeted Proteomics for the Detection of SARS-CoV-2 Proteins. biorxiv. 2020.
3. Surjit M, Lal SK. The Nucleocapsid Protein of the SARS Coronavirus: Structure, Function and Therapeutic Potential. In: Molecular Biology of the SARS-Coronavirus. 2009;129–151.
4. Dhaenens M et al. A Universally Adoptable Corona MRM Assay. Cov-MS Consortium. 2020.