Improved Recovery of a Lipid Conjugated Antisense Oligonucleotide from Human Plasma using the OligoWorks™ SPE Microplate Kit and an Optimized Protocol

Význam tématu

Oligonukleotidové terapie se rychle rozvíjejí v oblasti genové terapie a personalizované medicíny. Pro jejich úspěšný výzkum a vývoj je nezbytné spolehlivé a citlivé kvantitativní stanovení v komplexních biologických matricích, jako je lidská plazma. Konjugace oligonukleotidů s lipidy zvyšuje výzvy při extrakci a snižuje návratnost, což negativně ovlivňuje citlivost LC-MS metod.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout jednoduchý, kitový workflow pro extrakci lipidově konjugovaného antisense oligonukleotidu (ASO) z lidské plazmy. Autoři porovnali standardní protokol OligoWorks SPE Microplate Kitu s optimalizovaným postupem, který měl zajistit vyšší návratnost a lepší analytické parametry při nízkém objemu vzorků (100 µl).

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byla využita kombinace enzymatické digesce a SPE na 96-well mikrodesorpční destičce:

• Proteinase K digesce (RapiZyme Proteinase K Module): původně 1 hodina při 55 °C, optimalizováno na 2 hodiny a dvojnásobné množství enzymu
• Přidání noniontového surfaktantu NP-40 Alternative (1 %) k rozrušení komplexů ASO–protein
• WAX SPE sorbent (OligoWorks Mixed-Mode Weak Anion Exchange) pro selektivní retenci negativního řetězce oligonukleotidu
• µElution formát umožňující eluovat ve 25 µl bez následné evaporace a rekonstituce

Instrumentace pro LC-MS analýzu:

• ACQUITY I-Class PLUS UPLC System
• ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 kolona, 1,7 µm, 2,1 × 50 mm
• Xevo TQ-XS Tandemový kvadrupólový hmotnostní spektrometr, ESI- (možné použití Xevo TQ Absolute pro vyšší citlivost)

Hlavní výsledky a diskuse

Po aplikaci výchozího protokolu byla zjištěna nízká až střední návratnost lipid-ASO z různých plazmatických vzorků (K2EDTA, NaHep, LiHep). Optimalizovaný postup s prodlouženou digescí, 2× Proteinase K a 1% NP-40 Alternative vedl k významnému zvýšení návratnosti až na 99 %. Analytické parametry metody:

• Lineární odezva s R2 ≥ 0,99
• Dynamický rozsah 5–2 500 ng/mL
• Limit kvantifikace (LLOQ) 5 ng/mL z 100 µl plazmy
• Přesnost v rámci ±15 % nominální hodnoty bez použití vnitřního standardu

Přínosy a praktické využití metody

Kitový přístup minimalizuje čas a úsilí při vývoji vzorkovacího postupu, je kompatibilní s automatizovanými platformami a umožňuje „walk-away“ práci. Vysoká návratnost a citlivost metody podporují biofarmaceutický výzkum ADME/DMPK oligonukleotidových léčiv, zejména při omezeném objemu vzorku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zlepšení citlivosti nasazením systémů Xevo TQ Absolute a rozšíření aplikace na ostatní biologické matrice (tkáně, moč). Integrace do vysokopropustných platforem a kombinace s novými sorbenty či surfaktanty může dále optimalizovat extrakci modifikovaných oligonukleotidů.

Závěr

Standardizovaný, kitový postup OligoWorks SPE Microplate Kit s optimalizovanou enzymatickou digescí a mírnou úpravou wash-kroků dosahuje plné návratnosti lipidově konjugovaného ASO z lidské plazmy a nízkého LLOQ při minimálním objemu vzorku. Metoda je robustní, snadno použitelná i pro méně zkušené uživatele a významně zrychluje bioanalytický workflow.

Reference

• Transparency Market Research (2024). Oligonucleotides Market Outlook 2034: Projected to Reach US$ 13.1 Billion by 2034.
• Lilly Whitepaper (2024). Overview and Outlook for RNA-Based Therapies.
• Tran P, Weldemichael T, Liu Z, Li HY (2022). Delivery of Oligonucleotides: Efficiency with Lipid Conjugation and Clinical Outcome. Pharmaceutics, 14(2):342.
• Araya M. et al. (2023). Elements of Robust SPE-Based Oligonucleotide Extraction. Waters Application Note, 720008414.