ELEMENTS OF ROBUST MODIFIED OLIGONUCLEOTIDE EXTRACTION THROUGH SPE

Význam tématu

Extrahování a kvantifikace terapeutických oligonukleotidů v biologických vzorcích je zásadní pro pochopení jejich distribuce, metabolismu a vylučování. Robustní vzorková příprava a selektivní čištění minimalizují matriční interferenci a zajišťují přesné a reprodukovatelné DMPK údaje.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na vývoj a validaci SPE metody pro extrakci modifikovaných i nemodifikovaných oligonukleotidů z plazmy. Hlavními cíli byly: optimalizace aniontově-výměnných sorbentů, konfigurace workflow RapiZyme Proteinase K pro odbourání proteinů a nastavení chromatografických a hmotnostně spektrometrických podmínek pro kvantifikaci.

Použitá metodika a instrumentace

Bylo provedeno následující:

• Screening sorbentů Oasis WAX (30 µm) ve 1cc SPE kartáčcích s testovací směsí L-tyrosin, 20-mer ssDNA a lipid-konjugovaným ASO.
• Denaturační proteolýza plazmy RapiZyme Proteinase K modulem pro rozklad proteinů.
• SPE pomocí OligoWorks SPE Kit s optimalizovanou sorbentovou šarží s mixovanou reverzně-fázovou a slabou aniontovou výměnnou funkcionalitou.
• IP-RP-LC-UV analýza na ACQUITY UPLC s Oligonucleotide BEH C18 kolonkou (130 Å, 1.7 µm) při 60 °C, detekce při 260 nm s gradací TEAA/acetonitril.
• IP-RP-LC-UV-MS analýza lipid-konjugovaného ASO na BioAccord systému s RDa detektorem v negativním iontovém režimu.
• Size Exclusion Chromatography plazmy po proteolýze na ACQUITY Premier SEC 250 Å kolonce.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované sorbenty Oasis WAX prokázaly vysokou a konzistentní výtěžnost extrakce pro oba testované analyty (20-mer ssDNA a lipid-ASO). Chromatografické podmínky umožnily rozlišení diastereomerů lipid-konjugovaného ASO a přesnou detekci základního oligomeru i s nízkým podílem oxidovaných forem. RapiZyme Proteinase K dokončil odbourání plazmatických proteinů do 40 minut, což výrazně zlepšilo čistotu vzorku před SPE.

Přínosy a praktické využití metody

Nově vyvinutý OligoWorks SPE Kit nabízí:

• Reprodukovatelné a certifikované loty sorbentu pro stabilní výtěžnost extrakce oligonukleotidů.
• Kompatibilitu s nemodifikovanými i lipid-konjugovanými ASO.
• Jednoduchou integraci do IP-RP-LC-UV(-MS) workflow v bioanalytických laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší uplatnění multifunkčních sorbentů pro extrakci různých typů nukleových kyselin a jejich konjugátů. Integrace s automatizovanými SPE stanicemi a pokročilými MS detektory slibuje další zvýšení throughputu a citlivosti. Dále se rozvíjí alternativní proteolytické moduly a on-line čištění vzorků pro real-time bioanalytické aplikace.

Závěr

Vyvinutá SPE metoda s Oasis WAX sorbentem v rámci OligoWorks SPE Kit poskytuje robustní, selektivní a reprodukovatelné řešení pro extrakci terapeutických oligonukleotidů z biologických vzorků. Kombinace optimalizované předúpravy, chromatografie a MS detekce zaručuje vysokou kvalitu bioanalytických dat.

Reference

1. www.waters.com/oligoworks