EBF: ELEMENTS OF ROBUST MODIFIED OLIGONUCLEOTIDE EXTRACTION THROUGH SPE

Význam tématu

Robustní extrakce terapeutických oligonukleotidů je klíčová pro studium jejich farmakokinetiky a metabolizace v biologických vzorcích. Optimalizace vzorkovací přípravy a výběr vhodné sorbentové fáze zvyšují selektivitu, výtěžnost a opakovatelnost analýzy.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřuje na:

• Hodnocení a výběr iontoměničových sorbentů s reverzní fází pro extrakci modifikovaných a nemodifikovaných oligonukleotidů.
• Optimalizaci workflow SPE pro referenční materiály 20-mer ssDNA a lipidově konjugovaných ASO v plazmě.
• Ověření účinnosti proteolytické digesce plazmatických proteinů před chromatografií.

Použitá metodika a instrumentace

• Sorbentová screeningsetkání na 1 cc kartridžích Oasis WAX (30 µm) s testovací směsí L-tyrosin, 20-mer ssDNA a lipid-konjugovaného ASO.
• Digesce plazmy pomocí RapiZyme Proteinase K Modulu za denaturačních podmínek.
• SPE workflow: nabití, promývání a eluční podmínky pro selektivní retenci oligonukleotidů.
• IP-RP-LC-UV na ACQUITY UPLC s Premier Oligonucleotide BEH C18 1,7 µm, 2,1×50 mm, mobilní fáze TEAA gradient 0,1–100 % v 15 min při 0,6 mL/min, detekce při 260 nm.
• IP-RP-LC-UV-MS na BioAccord System s RDa detektorem, mobilní fáze DIPEA/HFIP v ACN-vodní směsi, eluce 35–90 % B během 11 min.
• SEC po digesci na Premier SEC 250 Å, 1,7 µm, 4,6×150 mm s 2× PBS při 0,2 mL/min pro kontrolu odstraňování proteinů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Výběr nejlepšího batch sorbentu Oasis WAX pro reprodukovatelnou extrakci, potvrzený testy šesti analyzátů a dvěma oligonukleotidy.
• LC-UV profily před a po SPE prokazují účinné odstranění nečistot a vysokou návratnost cílových oligonukleotidů.
• IP-RP-LC-UV-MS umožňuje rozlišení diastereomerů lipid-konjugovaných ASO, identifikace intaktního oligomeru (6047 Da) a nízké množství oxygenované formy (6031 Da).
• SEC analýza ukazuje kompletní proteolytickou digesci plazmatických proteinů do 40 min, což zajišťuje čistotu vzorku pro následnou chromatografii.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje:

• Reproducibilní a certifikovanou extrakci modifikovaných i nemodifikovaných oligonukleotidů.
• Reference materiály 20-mer ssDNA a lipid-konjugovaných ASO pro validaci workflow.
• Jednotný postup vhodný pro LC-UV i LC-MS kvantifikaci v bioanalytických studiích DMPK.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace přípravy vzorků a integrace s vysokopropustnými platformami pro screening většího počtu vzorků.
• Vývoj nových multimodálních sorbentů pro zlepšení selektivity u dalších typů modifikovaných oligonukleotidů.
• Expandování metodiky na jiné biologické matrice (tkáně, mozek, mozek).
• Využití umělé inteligence pro optimalizaci chromatografických podmínek a predikci výtěžnosti.

Závěr

Pečlivý výběr a validace iontoměničových sorbentů Oasis WAX spolu s optimalizovanou proteolytickou přípravou vzorků poskytují robustní, reprodukovatelnou a vysoce selektivní extrakci terapeutických oligonukleotidů. Prokazatelná účinnost a jednoduchá integrace s LC-UV a LC-MS metodami zajišťují široké uplatnění ve farmakokinetických a bioanalytických aplikacích.

Reference

Žádná explicitní literatura uvedena.