TOWARDS IN-VITRO DIAGNOSTIC IMAGING OF HEPA-RG SPHEROIDS BY DESI TANDEM QUADRUPOLE MS

Význam tématu

In vitro modely 3D kultivovaných buněk, zejména hepatocytární spheroidy HepaRG, představují pokročilý přístup k hodnocení hepatotoxicity a distribuce léčiv ve tkáňově podobném prostředí. Cílená obrazová analýza pomocí desorpční elektrosprejové ionizace (DESI) a tandemové kvadrupólové hmotnostní spektrometrie (MS/MS) umožňuje detailní mapování lokalizace a kvantifikaci léčiv a jejich metabolitů bez nutnosti sekce vzorku.

Cíle a přehled studie

Studie byla zaměřena na optimalizaci a demonstraci vysoce citlivého cíleného MS imagingu léčiv ve 3D hepatických spheroidech. Jako modelové látky byly zvoleny perhexilin, karbamazepin a warfarin, jejichž hepatotoxicita je dobře charakterizována. Primárním cílem bylo stanovit detekční limity, zobrazit vnitřní distribuci látek ve spheroidech a ověřit schopnost metody zachytit i nízké terapeutické koncentrace.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy spheroidů:

• HepaRG spheroidy kultivovány 7 dní.
• Dávkování perhexilinem (0,004–10 µM), karbamazepinem a warfarinem (0,4–1000 µM).
• Odmytí PBS, naložení na polylysinem potažené skleněné podložky a sušení v desikátoru.

Analytická platforma:

• Waters Xevo TQ Absolute s DESI XS zdrojem.
• MRM režim pro vybrané prekurzorové a produktové ionty léčiv a hlavních metabolitů.
• Optimalizace polarity, kuželového napětí a kolizní energie na základě provedeného SIR screeningu a literárních dat.
• Rozlišení pixelu 100×100 µm, scan rate 5–10 Hz.

Hlavní výsledky a diskuse

Detekční limity:

• Perhexilin: 0,04 µM (~9,1 pg na target).
• Karbamazepin: 0,4 µM (~94,5 pg) bez detekce epoxidového metabolitu.
• Warfarin: 0,4 µM (~123 pg), signál však vykazoval interferenci z DMSO kontrol.

Distribuce ve spheroidech:

• Perhexilin vykazoval koncentraci v centru spheroidu, což naznačuje účinnou penetraci a akumulaci.
• Vysoké dávky perhexilinu a karbamazepinu vedly k poruše morfologie spheroidů, známce cytotoxického účinku.

Zjištěná interference v kontrole DMSO zdůraznila nutnost korekce signálu pro jednoznačné vyhodnocení nízkých koncentrací. Přidání lipidních markerů (m/z 782,6 a 682,6) umožnilo prostorové zarovnání obrazů a posouzení integrity vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlou a citlivou lokalizaci léčiv a metabolitů ve 3D buněčných modelech.
• Možnost vyhodnocení farmakokinetiky a toxicitních efektů v jednom cejchu.
• Podporu rozhodování při výběru kandidátních sloučenin před in vivo testováním.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Srovnání obrazů neporušených a sekcionovaných spheroidů pro detailnější prostorové rozlišení.
• Integrace plnohodnotných metabolomických analýz (discovery) za účelem korelace distribuce léčiva s metabolickými změnami.
• Rozšíření na další 3D kultury a ko-kultury pro komplexnější modelování toxikologie.
• Automatizace procesu vzorkování a analýzy pro vyšší průchodnost a reprodukovatelnost.

Závěr

Cílené DESI MS/MS imaging na platformě Xevo TQ Absolute s DESI XS prokázalo vysokou citlivost při detekci léčiv a jejich metabolitů ve 3D spheroidech HepaRG. Metoda umožnila mapování distribuce látek na úrovni terapeutických koncentrací a poskytuje cenný nástroj pro farmaceutický vývoj a toxikologii.

Reference

• Ju W. et al. Austin J Anal Pharm Chem. 2014;1(2).
• van Rooyen GF. et al. J Chromatogr B. 2002;769:1–7.
• Zhang M. et al. J Chromatogr B. 2009;877:3025–3030.