Molecular Confirmation of Oligonucleotides Using Agilent LC/MSD XT and OpenLab CDS

Význam tématu

Potvrzení molekulové hmotnosti syntetických oligonukleotidů je nezbytné pro zajištění kvality a reproducibility v biotechnologickém výzkumu, farmaceutickém vývoji a diagnostických aplikacích. Rychlá a přesná analýza pomáhá identifikovat plnohodnotné produkty i nežádoucí nečistoty, což urychluje rozhodovací procesy v QA/QC a usnadňuje optimalizaci syntézy.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo demonstrovat pracovní postup pro potvrzení molekulové hmotnosti a základní charakterizaci syntetických oligonukleotidů pomocí kombinace Agilent LC/MSD XT a softwaru OpenLab CDS 2.8 s funkcí spektální dekonvoluce. Studie zahrnovala analýzu DNA žebříčku (15–40mer) a antisense oligonukleotidů (ASO), včetně detekce nízko hladinových nečistot.

Použitá metodika

Vzorky oligonukleotidů se rozpustily v deionizované vodě (50 µg/mL pro ASO, 4 nmol/µL pro žebříček). Chromatografie probíhala na Agilent AdvanceBio kolónách (2,1×50 mm, 2,7 µm) při 65 °C s mobilní fází A (100 mM HFIP, 15 mM TEA ve vodě) a B (methanol). Gradient šel z 15 % B na 30 % během 10 min a poté na 95 % B na 11 min při průtoku 0,5 mL/min.

Spektrometrie využila Agilent LC/MSD XT s elektrospray ionizací v negativním režimu. Parametry: suchý plyn 275 °C/12 L/min, tlak mlžítka 35 psi, kapilární napětí 4 500 V, rozsah skenu 1 000–3 000 m/z, fragmentor 175 V. Dekonvoluce probíhala v OpenLab CDS 2.8 s optimalizovanými nastaveními (MW rozsah 4 000–13 000 Da, max. náboj 40, minimálně 4 píky, tolerance 0,01 % apod.).

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II BioLC nebo passivovaný 1290 Infinity II LC
• Agilent LC/MSD XT (G6135C) s ESI zdrojem (G1948B)
• OpenLab CDS 2.8 s modulem pro spektální dekonvoluci

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza DNA žebříčku ukázala konzistentní dekonvoluované hmotnosti 15mer až 40mer s odchylkou do ±1 Da (hmotnostní přesnost do ~100 ppm). Změna délky a sekvence ovlivnila distribuci nábojových stavů (3–13), což demonstruje nutnost empirické optimalizace. Detekce n-1 nečistoty u 18mer a 20mer ASO byla úspěšná, s odpovídající dekonvoluovanou hmotností ~6 913 Da a relativním zastoupením 0,12 % hlavního signálu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé potvrzení molekulové hmotnosti syntetických oligonukleotidů
• Jednoduchá detekce a kvantifikace nízko hladinových nečistot
• Univerzální přístup pro oligos různých délek a modifikací
• Uživatelsky přívětivé rozhraní i pro rutinní QA/QC

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace vysokorozlišující hmotnostní spektrometrie pro detailnější charakterizaci
• Automatizace přípravy vzorků a analýzy s využitím robotických systémů
• Využití strojového učení pro pokročilou dekonvoluci a predikci chování iontů
• Rozvoj metod pro simultánní analýzu více typů modifikovaných oligonukleotidů

Závěr

Kombinace Agilent 1290 Infinity II LC/MSD XT a OpenLab CDS 2.8 představuje robustní a efektivní platformu pro molekulární potvrzení a základní charakterizaci syntetických oligonukleotidů. Nabízí optimální poměr rychlosti, přesnosti a univerzálnosti pro rutinní i ad-hoc analýzy.

Reference

• Chen B.; Mason S. F.; Bartlett M. G. The Effect of Organic Modifiers on Electrospray Ionization Charge-State Distribution and Desorption Efficiency for Oligonucleotides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2013, 24(2), 257–264. DOI:10.1007/s13361-012-0509-5
• Basiri B.; Murph M. M.; Bartlett M. G. Assessing the Interplay Between the Physicochemical Parameters of Ion-pairing Reagents and the Analyte Sequence on the Electrospray Desorption Process for Oligonucleotides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2017, 28(8), 1647–1656. DOI:10.1007/s13361-017-1671-6