Oligonucleotide Mass Confirmation and Impurity Identification

Význam tématu

Potvrzení molekulové hmotnosti (MW) a identifikace nečistot syntetických oligonukleotidů jsou klíčové pro garantování jejich kvality, bezpečnosti a účinnosti v biotechnologiích a farmaceutickém průmyslu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat použití systému Agilent InfinityLab LC/MSD XT a softwaru Agilent OpenLab CDS s funkcí spektrální dekonvoluce pro přesné stanovení MW a detekci nečistot u různých typů oligonukleotidů, včetně RNA standardů, antisense oligonukleotidů a dalších modifikovaných sekvencí.

Použitá metodika

Analýza probíhala za použití reverzní chromatografie na koloně AdvanceBio Oligonucleotide s gradientem 15 mM TEA/100 mM HFIP ve vodě a methanolu. Detekce probíhala na jednotkové hmotnostní spektrometrii (SQ-MS) v negativním módu, scan rozsah m/z 1 000–3 000, s následnou spektrální dekonvolucí. Dekonvoluční parametry jako rozsahy MW, prahové hodnoty signálu a algoritmy Curve Fit byly optimalizovány pro různé délky a modifikace oligonukleotidů.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II bio LC (pumpa, multisampler s chlazením, multicolumn termostat, DAD detektor)
• Agilent InfinityLab LC/MSD XT systém (jednočtvercový hmotnostní spektrometr)
• Agilent OpenLab CDS verze 2.8 se spektrální dekonvolucí

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza standardních RNA oligonukleotidů (14–21 mer) prokázala vysokou chromatografickou rozlišitelnost a přesnost MW v rozmezí ±0,5 Da. U různých vzorků oligonukleotidů (4–12 kDa) byla potvrzena molekulová hmotnost plnohodnotných produktů (FLP) s odchylkou < 0,3 Da. U cDNA klonovacích primerů se třemi sekvenčními variantami bylo díky širokému rozsahu MS detekováno až sedm nábojových stavů a jednotlivé varianty byly rozlišeny i při koeluci chromatogramu. Identifikace nečistot u modifikovaného ASO-21mer zahrnovala n-1 až n-9 zkrácené řetězce a addukty, s reprodukovatelnou retencí RT < 0,3 % RSD a relativní UV plochou nečistot < 5 % RSD.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a přesné stanovení MW syntetických oligonukleotidů bez nutnosti HRMS
• Automatizované zpracování dat a dekonvoluce v rámci OpenLab CDS
• Vhodné pro rutinní QA/QC, vývoj a validaci oligonukleotidových léčiv

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj pokročilých algoritmů dekonvoluce pro komplexnější směsi
• Integrace s automatizovanými platformami pro vysokokapacitní analýzu
• Využití umělé inteligence pro predikci a identifikaci nečistot
• Adaptace metodiky pro nové třídy modifikovaných nukleotidů

Závěr

Prokázaná kombinace Agilent InfinityLab LC/MSD XT a OpenLab CDS 2.8 nabízí robustní, reprodukovatelnou a uživatelsky přívětivou platformu pro standardní rutinní analýzu oligonukleotidů. Metoda spojuje dostatečnou hmotnostní přesnost, citlivost a rychlost měření v jedné workflow.

Reference

1. Oligonucleotide Characterization by Agilent 1290 Infinity II Bio LC and 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF. Agilent Technologies, 2023.
2. Unit Mass Spectral Deconvolution for Molecular Weight Confirmation of Large Molecules. Agilent Technologies, 2024.
3. Capaldi D. et al. Impurities in Oligonucleotide Drug Substances and Drug Products. Nucleic Acid Ther. 2017, 27(6):309–322.
4. Pourshahian S. Therapeutic Oligonucleotides, Impurities, Degradants, and Their Characterization by Mass Spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 2021, 40(2):75–109.