High-throughput Ion-Pairing Free Reversed Phase Analysis of Oligonucleotides using RapidFire Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá analýza oligonukleotidů je kritická pro vývoj terapeutických nukleových kyselin, kontrolu kvality ve farmaceutické výrobě a základní výzkum v genomice. Tradiční metody s iontovými paryteli často trpí znečištěním analytického systému a omezením při přechodu mezi metodami.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie je představit novou vysokopropustnou metodu bez použití iontových parů pro reverzněfázovou LC/MS analýzu oligonukleotidů. Metoda využívá systém Agilent RapidFire 400 spojený s AdvanceBio LC/Q-TOF a MS-přátelské fázové složení založené na amonném uhličitanu.

Použitá instrumentace

• Agilent RapidFire 400 pro online solid phase extraction na PLRP-S cartridge
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Jet Stream ESI zdrojem
• PLRP-S, 30 µm, 1000 Å, 4 µl objem náplně

Použitá metodika

Vzorky oligonukleotidů (18–60 nukleotidů, včetně modifikovaných ASO a siRNA) byly ředěny na 10 µM ve vodě. RapidFire provádí sekvence:

• Aspirace vzorku (600 ms)
• Load/wash (desalting) s 98 % 30 mM amonného uhličitanu a 2 % acetonitrilu, 1 mL/min, 4 000 ms
• Eluce do MS s 50 % 30 mM amonného uhličitanu a 50 % acetonitrilu, 0,5 mL/min, 5 000 ms
• Re-equilibrace 500 ms

MS akvizice v pozitivním režimu, 400–3 200 m/z, 4 spektra/s. Pro siRNA byly sníženy teploty zdroje a fragmentor k omezení in-source fragmentace.

Hlavní výsledky a diskuse

• Analýza 20mer, 30mer, 40mer a 60mer ukázala pokles intenzity iontů s rostoucí délkou sekvence, dekonvoluce potvrdila kvalitní signál pro všechny délky.
• Různé typy oligonukleotidů (ASO, siRNA, Givosiren, Fomivirsen) včetně modifikovaných vzorků byly detekovány s vysokou citlivostí.
• Reprodukovatelnost: dvanáct replikací Nu ASO mělo vyrovnané chromatogramy a konzistentní dekonvoluovaná spektra.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí 12s cyklus od vzorku k datu, bez kontaminace iontovými pary, což zvyšuje flexibilitu přístrojového vybavení. Vhodná pro vysokopropustné testování v QA/QC a rychlý screening nových terapeutických oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody pro sekvenační analýzu nukleových kyselin, pokročilé biochemické modifikace a integrace do plně automatizovaných platforem pro vysoce propustné laboratoře.

Závěr

Beziontová reverzná fáze s RapidFire 400 a LC/Q-TOF poskytuje rychlou, citlivou a reprodukovatelnou analýzu širokého spektra oligonukleotidů bez nutnosti iontových par.

Reference

1. Rye P Yang Y Agilent Technologies application note publication number 5994-3753EN 2022
2. Rye P Agilent Technologies application note publication number 5994-4945EN 2022