Sensitive LC-MS/MS quantitation of antisense oligonucleotides in plasma using the TSQ Altis Plus mass spectrometer

Význam tématu

Metody kvantitativní analýzy antisense oligonukleotidů v biologických vzorcích jsou klíčové pro sledování jejich farmakokinetiky a metabolického osudu.
Zvyšující se počet ASO terapeutik ve klinických studiích vyžaduje vysoce citlivé a selektivní nástroje pro spolehlivou detekci v nízkých koncentracích.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo optimalizovat a validovat LC-MS/MS metodiku využívající systém Vanquish Horizon UHPLC a hmotnostní spektrometr TSQ Altis Plus pro kvantifikaci ASO v lidské plazmě.
Metoda zahrnuje chromatografické oddělení v iontově-vazebné zpětné fázi (IPRP-LC) a selektivní monitorování reakcí (SRM) pro dosažení vysoké specifičnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy byly extrahovány jednorázovým procesem kapalné extrakce (LLE) s fenol/chloroform/isoamylalkoholem (25:24:1) v pufru Tris-EDTA pH 8,0.
Chromatografie probíhala na C18 kolonce (2,1×50 mm, 2,6 µm) pomocí gradientu 5–80 % acetonitrilu s DIPEA a HFIP, průtok 0,25 mL/min, objem injekce 20 µL.
Hmotová spektrometrie byla provozována na TSQ Altis Plus v negativním ionizačním režimu s optimalizovanými parametry SRM pro kvantifikaci analyzovaných ASO.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Horizon (systémová základna, binární pumpa, split samplér, kolonna komora)
• Hmotový spektrometr: Thermo Scientific TSQ Altis Plus
• Software: Chromeleon CDS verze 7.3.2

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje dolní meze kvantifikace (LLOQ) 0,10 ng/mL pro oba cílové ASO se správností lepší než 80 % a přesností do 10 %.
Lineární rozsah metody pokrývá koncentrace 0,10–100 ng/mL s koeficientem determinace R2 = 0,998 při váhování 1/x.
Chromatografické oddělení umožňuje přímé odlišení ASO od složek plazmatické matrice s minimálními rušivými vlivy.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a robustní jednoetapová příprava vzorku
• Vysoká specifičnost a selektivita díky SRM detekci
• Kompatibilita s regulovaným prostředím a cGLP reportingem

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metodiky na multiplexní analýzu dalších modifikovaných oligonukleotidů a jejich metabolitů.
Integrace pokročilých softwarových nástrojů a strojového učení pro automatizaci a zvýšení throughput.
Příležitost aplikace v klinických PK/PD studiích a personalizované medicíně.

Závěr

Prokázaná citlivá a selektivní LC-MS/MS metoda poskytuje spolehlivou kvantifikaci ASO v lidské plazmě.
Jednoduchá příprava vzorku a integrované raportování umožňují její nasazení v bioanalytických a regulačních laboratořích.

Reference

• Bennett, C. F. et al. Pharmacology of antisense drugs. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2017, 57, 81–105.
• Dhuri, K. et al. Antisense oligonucleotides: an emerging area in drug discovery and development. J. Clin. Med. 2020, 9(6), 2004.
• Patrinos, G., Danielson, P., Ansorge, W. Molecular Diagnostics, 3rd Edition, Elsevier, 2017.