Sensitive quantitation of antisense oligonucleotides in plasma using high-resolution, accurate-mass (HRAM) mass spectrometry

Význam tématu

Antisense oligonukleotidy (ASO) představují perspektivní třídu léčiv určených k regulaci genové exprese cílových proteinů. Jejich rychlý rozvoj u farmaceutických společností a rostoucí počet schválených léčiv vyvolává potřebu citlivých, specifických a reprodukovatelných bioanalytických metod pro měření jejich koncentrací v biologických maticích, především v lidské plazmě. Vysoce rozlišená a přesná (HRAM) hmotnostní spektrometrie ve spojení s iontově-párovanou kapalinovou chromatografií nabízí efektivní alternativu k tradičním ligand-binding assay a fluorimetrii.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je demonstrovat vývoj a validaci LC-HRAM-MS metody pro kvantifikaci dvou schválených ASO léčiv – fomivirsenu a nusinersenu – ve vzorcích lidské plazmy. Metoda využívá Vanquish Horizon UHPLC systém a Orbitrap Exploris 120 masový spektrometr řízený Chromeleon CDS. Studie ukazuje, že je možné dosáhnout nízkých mezí detekce (LLOQ) s vysokou přesností, linearitou a reprodukovatelností vhodnou pro podporu klinických studií.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byla zvolena jednoduchá kapalně-kapalná extrakce (LLE) směsí fenol/chloroform/isoamylalkohol s pH 8,0. Standardy ASO se připravily v nuclease-free vodě a následně naředily do plazmy v rozsahu 0,10–100 ng/mL. Po extrakci a vysušení se vzorky reconstiturovaly ve standardním roztoku s interním standardem (10 ng/mL).

• UHPLC separace: Vanquish Horizon UHPLC, C18 kolona 2,1×50 mm, gradient 8 min, mobilní fáze s DIPEA a HFIP.
• MS detekce: Thermo Scientific Orbitrap Exploris 120 v režimu tMS2, negativní ionizace, rozlišení 60 000, HCD kolizní energie 23 %.
• Software: Chromeleon CDS 7.3.2 pro řízení instrumentace, zpracování dat a reporting.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila dosažení LLOQ 0,20 ng/mL pro fomivirsin a 0,10 ng/mL pro nusinersen s přesností lepší než 20 % a opakovatelností do 15 % RSD. Linearita kalibračních křivek v rozsahu 0,10–100 ng/mL vykazovala koeficient determinace (R²) vyšší než 0,994. Tlakový gradient a vybrané fragmentační přechody (834,19→319,02 pro fomivirsin, 889,78→393,06 pro nusinersen) nebyly ovlivněny rušivými složkami plazmy. Fit-for-purpose report v Chromeleon CDS poskytl automatizované protokoly a záznamy o integraci píků v souladu s GLP požadavky.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda je vysoce citlivá, selektivní a rychlá, vhodná pro rutinní bioanalýzu v laboratořích provádějících farmakokinetické a toxikologické studie ASO léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se využití HRAM-MS pro širší škálu modifikovaných oligonukleotidů a multiplexní analýzy jejich metabolitů. Dalším krokem je automatizace přípravy vzorků a rozšíření ověřených metod do dalších biologických matic, například moči nebo tkání.

Závěr

Vyvinutá LC-HRAM-MS metoda na Orbitrap Exploris 120 spojená s Chromeleon CDS nabízí citlivé, přesné a reprodukovatelné stanovení fomivirsen a nusinersen v lidské plazmě. Díky jednoduché extrakci a rychlé analýze je řešení připravené pro regulované bioanalytické laboratoře podporující klinické hodnocení ASO léčiv.

Reference

1. Bennett CF, Baker BF, Pham N, Swayze E, Geary RS. Pharmacology of antisense drugs. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2017;57:81–105.
2. Dhuri K, Bechtold C, Quijano E, Pham H, Gupta A, Vikram A, Bahal R. Antisense oligonucleotides: an emerging area in drug discovery and development. J. Clin. Med. 2020;9(6):2004.