Analytical Solutions and Method Development Considerations for Quantitative Bioanalytical Oligonucleotide Studies

Význam tématu

Oligonukleotidová terapie představuje perspektivní přístup k léčbě dosud obtížně řešitelných onemocnění díky schopnosti cíleně modulovat genovou expresi. S rostoucím počtem antisenzových oligonukleotidů v klinickém vývoji roste i poptávka po citlivých a spolehlivých bioanalytických metodách, které umožní přesně měřit koncentrace léčiv v biologických vzorcích pro charakterizaci farmakokinetiky, účinnosti a bezpečnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout robustní kvantitativní metodu pro stanovení nusinersenu, 18-mer antisensního oligonukleotidu, v séru potkanů při sub-ng/mL úrovních. Použit byl kitový přístup k extrakci analyta z plazmy (OligoWorks SPE Microplate Kit), následovaný IP-RP UPLC chromatografií s HFIP/DIPEA iontovým párováním a detekcí v režimu MRM na Xevo TQ Absolute XR.

Použitá instrumentace

• Waters ACQUITY Premier UPLC System s ACQUITY Premier Oligonucleotide C18 kolonkou (1.7 µm, 2.1×50 mm)
• Waters Xevo TQ Absolute XR trojitý kvadrupólový hmotnostní spektrometr s negativní ESI
• waters_connect Software pro akvizici, zpracování a reporting dat
• OligoWorks SPE Microplate Kit pro přípravu a čištění vzorků

Použitá metodika

Vzorky plazmy byly denně připraveny nasycením kontrolních vzorků nusinersenem a zpracovány dle postupu OligoWorks, zahrnující broušení s Proteináze K, nanesení na WAX SPE mikrotitrační destičku a optimalizované praní vodu/methanolem (30 % MeOH). Chromatografie probíhala gradientem HFIP/DIPEA vodní a organické fáze při 60 °C, průtoku 0.6 mL/min, injekční objem 20 µL. Signalizace MRM sledovala přechody 890>393 a 890>95 m/z. Kalibrační křivka (0.1–1000 ng/mL) byla vyhodnocena váženou regresí 1/x.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace pracího pufru pro SPE (30 % methanolu) vedla k >100% výtěžku a <2% matrikových efektů. Metoda prokázala lineární oblast čtyř řádů s R2>0.9988 a LLOQ 0.1 ng/mL bez interferencí v blanku. QC úrovně (0.375, 0.75, 7.5, 75, 750 ng/mL) vykázaly přesnost 104.2–112.5 % a přesnost CV <7.3 %. MRM přechod 890>95 poskytl vyšší specifičnost díky diagnostickému fragmentu -O2PS.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a standardizovaná příprava vzorků s minimem vývojových úprav
• Vysoká citlivost a spolehlivost kvantifikace oligonukleotidů v matrikách
• Široký dynamický rozsah a nízké LLOQ vhodné pro farmakokinetické studie
• Kompatibilita s compliant-ready workflow v waters_connect Softwaru

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze adaptovat na další terapeutické oligonukleotidy v různých matricích, včetně tkání a moči. Očekává se další rozvoj ion-pair free separací, hyperlinkage hyphenací a plná automatizace přípravy vzorků, což zvýší throughput a reproducibilitu.

Závěr

Vyvinutá IP-RP UPLC-MRM metoda s OligoWorks SPE a Xevo TQ Absolute XR nabízí citlivou, přesnou a vysoce reproducibilní kvantifikaci nusinersenu v potkaní plazmě na sub-ng/mL úrovni. Metoda podporuje farmakokinetické a toxikologické studie oligonukleotidových terapií s minimalizací vývojového času a datové zátěže.

Reference

1. Takakusa H., et al. Drug Metabolism and Pharmacokinetics of Antisense Oligonucleotide Therapeutics: Typical Profiles, Evaluation Approaches, and Points to Consider Compared with Small Molecule Drugs. Nucleic Acid Ther 33(2): 83–94, 2023.
2. Yuan L., et al. A Novel Hybridization LC-MS/MS Methodology for Quantification of siRNA in Plasma, CSF and Tissue Samples. Molecules 28(4), 2023.
3. Liu A., et al. Bioanalysis of Oligonucleotide by LC–MS: Effects of Ion Pairing Regents and Recent Advances in Ion-Pairing-Free Analytical Strategies. Int J Mol Sci 23(24): 15474, 2022.
4. Damase T.R., et al. The Limitless Future of RNA Therapeutics. Front Bioeng Biotechnol 9, 2021.
5. Hayashi Y. a Sun Y. Overcoming Challenges in Oligonucleotide Therapeutics Analysis: A Novel Non-ion Pair Approach. J Am Soc Mass Spectrom 35(9): 2034–2037, 2024.
6. McCarthy S.M., Pourshahian S. Analysis of Oligonucleotides by Liquid Chromatography and Mass Spectrometry. In Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products, CRC Press, 2011.
7. Azarani A. a Hecker K.H. RNA Analysis by Ion-Pair Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography. Nucleic Acids Res 29(2): E7, 2001.
8. McGinnis A.C., et al. Chromatographic Methods for the Determination of Therapeutic Oligonucleotides. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 883–884: 76–94, 2012.
9. Guimaraes G.J. a Bartlett M.G. The Critical Role of Mobile Phase pH in the Performance of Oligonucleotide Ion-Pair LC-MS Methods. Future Sci OA 7(10): FSO753, 2021.
10. Donegan M., et al. Effect of Ion-Pairing Reagent Hydrophobicity on LC-MS Analysis of Oligonucleotides. J Chromatogr A 1666, 2022.
11. Hannauer F., et al. Advancements in the Characterisation of Oligonucleotides by HPLC-MS in 2021: A short review. Anal Sci Adv 3(3-4): 90–102, 2022.
12. Malarvannan M., et al. Advances in Analytical Technologies for Emerging Drug Modalities and their Separation Challenges in LC-MS Systems. J Chromatogr A 1732: 465226, 2024.
13. Nuckowski Ł., et al. Review on Sample Preparation Methods for Oligonucleotides Analysis by LC. J Chromatogr B 1090: 90–100, 2018.
14. Geary R.S., et al. Pharmacokinetics, Biodistribution and Cell Uptake of Antisense Oligonucleotides. Adv Drug Deliv Rev 87: 46–51, 2015.
15. Geary R.S. Antisense Oligonucleotide Pharmacokinetics and Metabolism. Expert Opin Drug Metab Toxicol 5(4): 381–391, 2009.
16. Yu R.Z., et al. Tissue Disposition of 2'-O-(2-methoxy) Ethyl Modified Antisense Oligonucleotides in Monkeys. J Pharm Sci 93(1): 48–59, 2004.
17. Chen B. a Bartlett M.G. Evaluation of Mobile Phase Composition for Enhancing Sensitivity of Targeted Quantification of Oligonucleotides using UHPLC-MS: Application to Phosphorothioate DNA. J Chromatogr A 1288: 73–81, 2013.
18. Zhang X., et al. HILIC/MS/MS Method for Determination of Nusinersen in Rabbit Plasma. Heliyon 10(10): e31213, 2024.
19. Xu T., et al. LC–MS/MS Assay for Quantitative Analysis of Nusinersen in Human CSF and Plasma. Biomed Chromatogr 39(7): e70138, 2025.
20. Tanna N., Lee M., Trudeau M. An Automated, Standardized, Kit-Based Sample Preparation Workflow for Bioanalytical Quantification of Therapeutic Oligonucleotides. Waters App Note, 2023.
21. Araya M., et al. Improved Bioanalytical Extraction of Therapeutic ASOs, Including Lipid Conjugated ASO From Tissue Using OligoWorks SPE Microplate Kit. Waters App Note, 2025.
22. Chiriboga C.A., et al. Results From a Phase 1 Study of Nusinersen in Children with Spinal Muscular Atrophy. Neurology 86(10): 890–897, 2016.
23. Waters Corp. Oligonucleotide Separation Technology Standard Care and Use Manual, 2025.
24. Waters Corp. IonHance HFIP Care & Use Manual, 2023.
25. IDT Resuspension Calculator, 2025.
26. Waters Corp. OligoWorks SPE Kits and Components Manual, 2025.
27. Guimaraes G.J., et al. Mobile Phase Aging and Its Impact on ESI of Oligonucleotides. J Am Soc Mass Spectrom 34(12): 2691–2699, 2023.
28. Waters Corp. Take Separations to the Max with MaxPeak Premier Columns, 2025.
29. Huang M., et al. Analytical Characterization of DNA and RNA Oligonucleotides by HILIC-MS/MS. J Chromatogr A 1648: 462184, 2021.
30. Kilanowska A., et al. HILIC-MS/MS for Retention and Sensitivity Studies of Antisense Oligonucleotides. J Chromatogr A 1622: 461100, 2020.
31. Studzińska S., et al. HILIC-MS in the Analysis of Phosphorothioate Oligonucleotides in Serum. J Chromatogr B 1040: 282–288, 2017.