Discovery of Potential Soluble Epoxide Hydrolase Inhibitors Using a High-Throughput Screening Assay on a 235 Compound Library

Význam tématu

Solubilní epoxid hydroláza (sEH) hraje klíčovou roli v metabolizmu epoxyeikosatrienových kyselin (EET) vznikajících z arachidonové kyseliny. Tyto látky vykazují významné protizánětlivé a kardioprotektivní účinky, které se ztrácí jejich hydrolýzou na dihydroxyeikosatrienové kyseliny. Inhibice sEH je proto atraktivní přístup pro zlepšení terapeutického profilu při léčbě zánětlivých a kardiovaskulárních onemocnění.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit automatizovaný vysokoprůchodový screening (HTS) pro identifikaci malých molekul inhibujících sEH v knihovně 235 protizánětlivých sloučenin společnosti Cayman Chemical. Využití plně automatizovaného přístrojového řešení umožnilo významně zkrátit dobu testování a zlepšit reprodukovatelnost měření.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Knihovna 235 sloučenin byla naředěna do černých 384-jamkových neabsorpčních desek.
• Testované látky byly aplikovány v sedmi koncentracích v polo­logaritmických křivkách.
• Enzymatická reakce probíhala přidáním rekombinantní lidské sEH a následně substrátu PHOME, sledované kineticky po dobu 20 minut (360 nm/460 nm).
• Kontrola kvality proběhla výpočtem Z´-faktoru (průměrně 0,60), indikujícího vysokou robustnost testu.

Instrumentace:

• Agilent Bravo s hlavou pro 384 kanálové pipetování
• Agilent BenchCel 4R pro manipulaci s deskami
• Agilent BioTek Synergy Neo2 hybridní multimodální čtečka

Hlavní výsledky a diskuse

Z celkem 235 testovaných protizánětlivých sloučenin bylo nalezeno 36 kandidátů s IC50 < 10 µM. Šest nejvýznamnějších sloučenin vykazovalo následující vlastnosti:

• SC-75741 (inhibitor NF-κB): sEH IC50 < 10 nM
• trans-AUCB (známý sEH inhibitor): sEH IC50 < 10 nM
• Ciclesonide (glukokortikoid): sEH IC50 ≈ 100 nM
• SCH 79797 (PAR1 antagonista): sEH IC50 ≈ 372 nM
• DuP-697 (selek­tivní COX-2 inhibitor): sEH IC50 ≈ 813 nM
• LCK Inhibitor (kináza LCK): sEH IC50 ≈ 6 070 nM

Některé sloučeniny vykazovaly při vyšších koncentracích vlastní fluorescenci, což bylo zohledněno při analýze dat. Objev dualních inhibitorů COX-2/sEH (DuP-697) i nových vedlejších aktivit známých farmak (SCH 79797, Ciclesonide) otevírá prostor pro kombinované modulační strategie lipiduální signalizace.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlost: screening 20 sloučenin za hodinu s celkovou analýzou za tři dny.
• Reprodukovatelnost: automatizace snížila variabilitu mezi a v rámci jamek.
• Škálovatelnost: platformu lze použít pro jiné enzymatické testy a větší knihovny.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na knihovny o tisících sloučenin pro objev vedlejších cílů (polyfarmakologie).
• Integrace s fenotypovými screeny buněčných modelů pro komplexnější hodnocení účinků.
• Modifikace assay pro jiné enzymy zapojené do metabolismu lipidů či farmakokinetiky.

Závěr

Automatizovaný HTS přinesl efektivní a spolehlivou metodiku pro identifikaci sEH inhibitorů ve stávajících farmakologických knihovnách. Objevené kandidáty nabídnou nové možnosti pro vývoj protizánětlivých a kardioprotektivních léčiv.

Reference

1. Lai J., Chen C. The Role of Epoxyeicosatrienoic Acids in Cardiac Remodeling. Front. Physiol. 2021;12:642470.
2. Spector A.A., Kim H.-Y. Cytochrome P450 Epoxygenase Pathway of Polyunsaturated Fatty Acid Metabolism. Biochim. Biophys. Acta. 2015;1851(4):356–365.
3. Zhang J.-H., Chung T.D.Y., Oldenburg K.R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 1999;4(2):67–73.
4. Leban J. et al. A Novel Class of Potent NF-κB Signaling Inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007;17(21):5858–5862.
5. Hwang S.H. et al. Synthesis and Structure-Activity Relationship Studies of Urea-Containing Pyrazoles as Dual Inhibitors of Cyclooxygenase-2 and Soluble Epoxide Hydrolase. J. Med. Chem. 2011;54(8):3037–3050.
6. Belvisi M.G. et al. Preclinical Profile of Ciclesonide, a Novel Corticosteroid for the Treatment of Asthma. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005;314(2):568–574.
7. Ahn H.S. et al. Inhibition of Cellular Action of Thrombin by SCH 79797, a Nonpeptide Thrombin Receptor Antagonist. Biochem. Pharmacol. 2000;60(10):1425–1434.
8. Kargman S. et al. Mechanism of Selective Inhibition of Human Prostaglandin G/H Synthase-1 and -2 in Intact Cells. Biochem. Pharmacol. 1996;52(7):1113–1125.
9. Burchat A.F. et al. Pyrrolo[2,3-d]Pyrimidines Containing an Extended 5-Substituent as Potent and Selective Inhibitors of lck II. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000;10(19):2171–2174.
10. Arnold L.D. et al. Pyrrolo[2,3-d]Pyrimidines Containing an Extended 5-Substituent as Potent and Selective Inhibitors of lck I. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000;10(19):2167–2170.
11. Cayman Chemical Company. Unpublished internal company data. 2000.