Fragment-Based Drug Discovery: Comparing Labeled and Label-Free Screening of β-Amyloid Secretase (BACE-1) Using Fluorescence Spectroscopy and Ultrafast SPE/MS/MS

Význam tématu

Fragment-based drug discovery (FBDD) poskytuje efektivní přístup k identifikaci nových inhibitorů enzymu β-amyloid secretázy (BACE-1), klíčového cíle v terapii Alzheimerovy choroby. Porovnání označených a neoznačených substrátů pomocí fluorescenční spektroskopie a ultrarychlého SPE/MS/MS odhaluje výhody a potenciální úskalí jednotlivých metod při detekci vazby fragmentů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie si kladla za cíl:

• Vyvinout a optimalizovat funkční biochemické testy pro BACE-1 se dvěma typy substrátů (označený a neoznačený).
• Porovnat kinetické parametry, výtěžnost a konzistenci zásahů (hitů) při detekci fluorescenční spektroskopií (FS) a vysokorychlostním hmotnostním spektrometrem Agilent RapidFire MS.
• Vyhodnotit, jak použití označených substrátů ovlivňuje výběr potenciálních inhibitorů.

Použitá metodika a instrumentace

Všechny reakce probíhaly v objemu 50 µL při 50 mM NaOAc pH 4,5, 50 mM NaCl, 0,03 % BSA, 0,0025 % Genapol a 20 nM BACE-1.

Substráty a koncentrace:

• Označený substrát: 10 µM
• Neoznačený substrát: 2 µM
• Testované fragmenty: 1 mM
• Inhibitor IV (plně inhibovaný kontrolní vzorek): 1 µM
• DMSO (negativní kontrola): 2 %

Detekce:

• Fluorescenční spektroskopie (Cary Eclipse): ex 394 nm, em 326 nm, štěrbiny 5 nm, doba sběru 0,1 s, rychlost ~2 s/vzorek.
• RapidFire 360 HT MS System (triple quadrupole, reversed-phase C4 SPE kazeta): Buffer A (voda + 0,1 % kys. formiové, 1,5 mL/min), Buffer B (acetonitril + 0,09 % kys. formiové + 0,01 % TFA, 1,25 mL/min), objem injekce 10 µL, rychlost ~10 s/vzorek.
• MRM přechody: označený substrát 668,0 → 101,8; označený produkt 777,3 → 532,1; neoznačený substrát 590,5 → 216,8; neoznačený produkt 561,3 → 217,0.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace testů odhalila odlišné kinetické vlastnosti:

• Neoznačený substrát: Km ≈ 22,4 µM; umožnil konstrukci klasické Michaelisovy-Mentenovy křivky.
• Označený substrát: nízká rozpustnost a afinitní změny znemožnily přesné určení Km.
• Inhibitor IV: IC50 zjištěné MS pro neoznačený substrát 16,2 nM, pro označený substrát FS 24,6 nM a MS 24,5 nM.

Screening 1 000 fragmentů vedl k odlišnému počtu zásahů (hits):

• Unlabeled MS (UMS): 211 zásahů
• Labeled MS (LMS): 32 zásahů
• Labeled FS (LFS): 122 zásahů
• Společných pro všechny tři formáty: 8 sloučenin

Identifikovány byly tři kategorie hitů:

1. Komponenty ovlivňující fluorescenci (autofluorescence) maskující silné inhibitory v FS.
2. Sloučeniny aktivní pouze vůči nativnímu (neoznačenému) substrátu – detekce možných farmakologicky relevantnějších inhibičních mechanismů.
3. Sloučeniny aktivní pouze vůči označenému substrátu – potenciální falešné odpovědi v případě aditivních interakcí s fluorescenčním označením.

Přínosy a praktické využití metody

Label-free screening pomocí Agilent RapidFire-MS:

• Odstraňuje artefakty spojené s fluorescenčními nebo jinými značkami.
• Umožňuje vysokorychlostní vyhodnocení (cca 10 s/vzorek), srovnatelné s běžnými fluorescenčními čítači.
• Studuje nativní substráty a poskytuje reálnější obraz afinity a inhibitory aktivity.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Integrace automatizovaných pracovních postupů a microfluidních platforem pro další zrychlení screeningů.
• Využití umělé inteligence a strojového učení k predikci a optimalizaci hitů bez nutnosti značení.
• Rozšíření label-free MS přístupů na další enzymatické a receptorové cíle v rané fázi objevování léčiv.

Závěr

Kombinace ultrarychlého SPE/MS/MS s metodikami FBDD nabízí robustní a spolehlivý přístup ke screeningu fragmentů na enzym BACE-1. Label-free detekce eliminuje potíže spojené s fluorescenčními značkami a umožňuje identifikovat inhibiční sloučeniny vůči nativnímu substrátu, čímž zvyšuje biologickou relevanci výsledků.

Reference

• EMD Biosciences. Beta-Secretase Inhibitor IV. EMD Millipore webová stránka, přístup 21. 8. 2012.