IMPROVED BIOPHARMACEUTICAL PEPTIDE MAPPING WORKFLOWS USING A NOVEL AUTOLYSIS-RESISTANT TRYPSIN ENZYME

Význam tématu

Peptidové mapování je klíčová technika v kvalitativní a kvantitativní analýze biofarmaceutických proteinů. Umožňuje detailní stanovení primární sekvence, identifikaci post-translačních modifikací a kontrolu integrity terapeutických monoklonálních protilátek. Robustní, rychlé a čisté digesční protokoly zvyšují spolehlivost výsledků, snižují čas analýzy a minimalizují nežádoucí vedlejší produkty, jako jsou nedokončené štěpení nebo autolýza enzymu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie porovnává nově vyvinutý autolýze odolný trypsin RapiZyme s komerčně dostupným MS-grade trypsinem. Cílem je ověřit jeho výkonnost v různých flexibilních protokolech (zrychlené 30minutové štěpení, tradiční 1–3hodinová inkubace, noční štěpení a jednoduchý jeden­hrnec bez desaltu) na modelové monoklonální protilátce (infliximab). Hlavními sledovanými parametry jsou sekvenční pokrytí, podíl očekávaných tryptických peptidů v TIC, míra nedokončeného štěpení a úroveň autolytických fragmentů.

Použitá instrumentace

• Chromatografie: ACQUITY Premier Peptide CSH C18 kolona (1,7 μm, 2,1×100 mm) při 60 °C, gradient 1–35 % organické fáze během 50 minut.
• Mobilní fáze: 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě (A) a 0,1 % kyseliny mravenčí v acetonitrilu (B).
• Mass spectrometrie: Xevo G3 QTof MS v režimu MSE a BioAccord Systems.
• Informatika: UNIFI peptide mapping workflow v platformě waters_connect.

Použitá metodika

• Denaturace a redukce: 5,2 M Guanidinium chlorid, 3 mM DTT, 30 min při pokojové teplotě.
• Alkylace: 7 mM iodoacetamid, 20 min při pokojové teplotě.
• Desalting: buffer exchange přes 7 kDa MWCO gel­filtrační kolonu do pH 7,5 (Tris/CaCl2) nebo pH 6,5 (Histidin/CaCl2) anebo přímý 1-Pot protokol bez desaltu.
• Digestní podmínky: E:P poměry 1:5 (30 min), 1:20 (1–3 h), 1:100 (15–18 h) a 1:5 (2 h bez desaltu). Inkubační teplota 37 °C nebo pokojová teplota pro noční štěpení.
• Zastavení reakce: kyselina octová do ~0,1 % a úprava na mobilní fázi A pro LC-MS.

Hlavní výsledky a diskuse

• Sekvenční pokrytí všech protokolů přesahuje 95 %, srovnatelné se standardním metodickým postupem.
• Podíl očekávaných tryptických peptidů v chromatografickém TIC dosahuje u RapiZyme až ~94 % oproti 88 % u srovnávacího trypsinu.
• Míra nedokončeného štěpení (missed cleavage) je u RapiZyme o 2–3 % nižší v protokolech s guanidiniem, pouze u jednohrncového protokolu je rozdíl menší (~7 % vs. ~5 %).
• Autolytické fragmenty nejsou detekovatelné ve vzorcích zpracovaných RapiZyme Trypsinem při vysokém E:P poměru, zatímco u konkurence jsou patrné významné autolytické signály.
• Chromatografické profily všech čtyř protokolů s RapiZyme vykazují vysokou vzájemnou podobnost, což ukazuje na reprodukovatelnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost rychlého digesčního protokolu (30 min) bez potřeby zvýšené teploty a s vysokým výtěžkem cílových peptidů.
• Snížení potřeby dodatečné kontroly neznámých špiček a komplexní redukce autolytických interferencí.
• Flexibilita nasazení v různých pracovních postupech od high-throughput screeningů až po hloubkové noční analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace autolýze odolných trypsinů do multi-atributních monitorovacích (MAM) workflow, jejich propojení s pokročilými DIA režimy hmotnostní spektrometrie a automatizovanými přístroji pro zvýšení efektivity a průkaznosti kvality bioterapeutik. Dalším směrem je optimalizace pro peptidové biomarkery v klinických vzorcích a rozšíření aplikací na jiná terapeutická proteiny.

Závěr

RapiZyme Trypsin představuje robustní a univerzální nástroj pro peptidové mapování biofarmaceutik. Díky vynikající odolnosti proti autolýze, vysoké aktivitě i v nepříznivých podmínkách a flexibilitě protokolů umožňuje zkrácení doby analýzy, zlepšení kvality dat a snížení časové i personální náročnosti laboratorních postupů.

Reference

1. Ippoliti S, Zampa N, Yu YQ, Lauber MA. Versatile and Rapid Digestion Protocols for Biopharmaceutical Characterization Using RapiZymeTM Trypsin. Waters Application Note 720007840EN. 2022 Dec.
2. Ranbaduge R, Yu YQ. A Streamlined Compliant Ready Workflow for Peptide-Based Multi-Attribute Method (MAM). Waters Application Note 720007094EN. 2020 Dec.
3. Mouchahoir T, Schiel JE. Development of an LC-MS/MS peptide mapping protocol for the NIST mAb. Anal Bioanal Chem. 2018;410:2111-2126.
4. Ren D, Pipes GD, Liu D, Shih L, Nichols A, Treuheit MJ, Brems DN, Bondarenko PV. An improved trypsin digestion method minimizes digestion-induced modifications on proteins. Anal Biochem. 2009;392:12-21.
5. Millian-Martin S, Jakes C, Carillo S, Buchanan T, Guender M, Kristensen DB, Sloth TM, Oregaard M, Cook K, Bones J. Inter-laboratory study of an optimized peptide mapping workflow using automated trypsin digestion for monitoring monoclonal antibody product quality attributes. Anal Bioanal Chem. 2020;412:6833-6848.
6. Hao Z, Moore B, Ren C, Sadek M, Macchi F, Yang L, Harris J, Yee L, Liu E, Tran V, Ninonuevo M, Chen Y, Yu C. Multi-attribute method performance profile for quality control of monoclonal antibody therapeutics. J Pharm Biomed Anal. 2021;205:114330.