Versatile and Rapid Digestion Protocols for Biopharmaceutical Characterization Using RapiZyme™ Trypsin

Význam tématu

Peptidové mapování představuje klíčový analytický postup v charakterizaci biofarmaceutik. Umožňuje detailní identifikaci proteinů a lokalizaci modifikací na úrovni peptidů. Významně se využívá v rámci přístupu multi-attribute monitoring (MAM), kde je požadována vysoká robustnost, přesnost a rychlost analýzy. Optimalizace proteolytických protokolů s ohledem na rovnováhu mezi úplností štěpení, minimalizací nespecifických štěpení, autolýzy trypsinu a vzniku nežádoucích posttranslačních modifikací je zásadní pro efektivní rozhodování v procesu vývoje a kontroly kvality bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo komplexně zhodnotit nové homogene metylované rekombinantní prasečí trypsin RapiZyme™ v řadě trávících protokolů pro biopharmaceutickou charakterizaci. Srovnání bylo prováděno s vedoucím průmyslovým MS-grade trypsinem ve čtyřech klíčových režimech:

• Tradiční štěpení (E:P 1:20, 1–3 hodiny, 37 °C, pH 7,5).
• Rychlé štěpení (E:P 1:5, 30 minut, 37 °C).
• Optimalizované noční štěpení (E:P 1:100, 20–25 °C, pH 6,5).
• One-pot bez předchozí desaltace (E:P 1:5, 2 hodiny, 37 °C, 0,6 M guanidinhydrochlorid).

Remicade™ (infliximab) posloužil jako modelový mAb. Hodnocení zahrnovalo sledování úplnosti štěpení, úroveň autolýzy, výskyt neznámých peptidů a umělých PTM.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly redukovány a alkylovány v guanidinhydrochloridu, poté případně desal­továny nebo naředěny pro one-pot protokol. Digesce probíhala v pufrech Tris/CaCl₂ (pH 7,5) nebo histidin/CaCl₂ (pH 6,5). Po ukončení reakce vzorky acidifikovány acetic acid a analyzovány LC-MS.

Použitá instrumentace

• LC systém: ACQUITY UPLC I-Class PLUS.
• Detekce UV: ACQUITY TUV.
• MS detektor: ACQUITY RDa (ESI+, full scan 50–2000 m/z, low/high energy ramping).
• Řízení a zpracování dat: UNIFI v3.0.0.6 s waters_connect 2.1.0.
• Kolona: ACQUITY Premier Peptide CSH C18, 130 Å, 1,7 µm, 2,1×100 mm.

Hlavní výsledky a diskuse

Tradiční digest (1:20 E:P, 3 h) poskytl srovnatelnou sekvenční pokrytí (>93 %) i nízké PTM jak pro RapiZyme, tak pro referenční trypsin. Zkrácení na 1 h prokázalo u RapiZyme obdobnou účinnost.
Rychlý protokol (1:5, 30 min) u RapiZyme vykázal <0,1 % autolýzy, <1 % chybějících štěpení a >93 % pokrytí, zatímco konkurent při vysokém E:P poměru generoval výrazné autolytické špičky.
Noční štěpení (1:100, pH 6,5, 20–25 °C) přineslo kompletní digest s <1 % nežádoucích produktů a minimalizovanou deamidací, oproti >20 % deamidaci při 37 °C a pH 7,5.
One-pot režim bez desaltace (1:5, 2 h) ukázal u RapiZyme 96 % TIC odpověď pro očekávané peptidy, zatímco referenční trypsin dosáhl jen 82 % a trpěl vyšší autolýzou i nedokončeným štěpením.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost implementace rychlých 30minutových a flexibilních nočních digestí do rutinního provozu.
• Redukce pracovních kroků díky one-pot protokolu bez nutnosti desaltace.
• Snížení náročnosti datové analýzy díky nízkému počtu neznámých a autolytických špiček.
• Vysoká opakovatelnost a konzistence mezi šaržemi enzymu.

Budoucí trendy a možnosti využití

RapiZyme trypsin lze integrovat do automatizovaných high-throughput workflow a MAM platforem pro kontrolu kvality bioterapeutik. Dalšími směry jsou optimalizace pro různé proteiny a vývoj podobně stabilních enzymů umožňujících práci v přítomnosti chaotropních činidel či za extrémních pH podmínek.

Závěr

Nový RapiZyme™ trypsin díky vylepšené autolýzní odolnosti a širokému rozpětí použitelných podmínek umožňuje rychlou, spolehlivou a flexibilní přípravu vzorků pro peptidové mapování. Umožňuje zkrátit dobu digestí, zjednodušit workflow a minimalizovat analytické artefakty bez kompromisů na kvalitě dat.

Reference

1. Ranbaduge R, Yu YQ. A Streamlined Compliant Ready Workflow for Peptide-Based Multi-Attribute Method (MAM). Waters Application Note, 720007094. 2020 Dec.
2. Mouchahoir T, Schiel JE. Development of an LC-MS/MS peptide mapping protocol for the NIST mAb. Anal Bioanal Chem. 2018;410:2111–2126.
3. Ren D et al. An Improved Trypsin Digestion Method Minimizes Digestion-Induced Modifications on Proteins. Anal Biochem. 2009;392:12–21.
4. Millian-Martin S et al. Inter-laboratory Study of an Optimized Peptide Mapping Workflow Using Automated Trypsin Digestion for Monitoring Monoclonal Antibody Product Quality Attributes. Anal Bioanal Chem. 2020;412:6833–6848.
5. Evans AR et al. ID-MAM: A Validated Identity and Multi-Attribute Monitoring Method for Commercial Release and Stability Testing of a Bispecific Antibody. Anal Chem. 2021;93(26):9166–9173.
6. Song YE et al. Automated Mass Spectrometry Multi-Attribute Method Analyses for Process Development and Characterization of mAbs. J Chrom B. 2021;1166:122540.
7. Hao Z et al. Multi-Attribute Method Performance Profile for Quality Control of Monoclonal Antibody Therapeutics. J Pharm Biomed Anal. 2021;205:114330.
8. Instruction Manual for PD-10 Desalting Columns. Cytiva #52130800 BD. Accessed via www.cytivalifesciences.com on 12 Dec 2022.