LC/UV/HRMS-based impurity profiling and structure elucidation of phosphoramidite raw materials used for oligonucleotide synthesis

Význam tématu

Analýza a charakterizace stopových nečistot ve stavebních blocích pro syntézu oligonukleotidů je klíčová pro zajištění kvality a bezpečnosti terapeutických přípravků. Fosforamiditové suroviny mohou obsahovat reakčně aktivní vedlejší produkty, které ovlivňují účinnost a čistotu konečného oligonukleotidu. Pečlivé profilování nečistot umožňuje lépe kontrolovat výrobní procesy a splnit regulatorní požadavky na léčivé látky.

Cíle a přehled studie

Účelem studie bylo demonstrovat spolehlivou identifikaci a strukturální objasnění stopových nečistot v 5′-DMT-2′-F-A(bz)-CEP získaných od různých dodavatelů. Studie využívá kombinaci RP-LC s UV detekcí a vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie (HRAM-MS) s MS/MS fragmentačními daty a softwaru Compound Discoverer.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky fosforamiditu (5′-DMT-2′-F-A(bz)-CEP) se připravily v acetonitrilu (1 mg/ml). Chromatografické oddělení proběhlo na systému Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC s kolonkou Accucore C18 (2,1×100 mm, 2,6 µm). Mobilní fáze A byla 10 mM acetát amonný ve vodě, fáze B acetonitril; gradient z 30 % B na 95 % B za 14 minut. Mass spektrometrie byla prováděna na Thermo Scientific Orbitrap Exploris 120 (m/z 200–1 200, rozlišení MS1 60 000, MS2 15 000, HCD CE 10/20/40 %). Data se zpracovávala v Chromeleon CDS 7.2.10 a Compound Discoverer 3.3 SP2.

Hlavní výsledky a diskuse

• Senzitivita: nečistoty byly detekovatelné na úrovni 0,01 % pomocí UV a 0,001 % v HRAM-MS.
• Profil nečistot se významně lišil mezi dodavateli, jak ukázaly overlay chromatogramy UV.
• Fragmentační spektra umožnila lokalizovat modifikace, například metylační odchylky na DMT ochraně.
• U isomerických nečistot s hmotností 909,3177 Da bylo možné určit pozici substituce chloru na ochraných skupinách.
• Integrace FISh algoritmu a transformačního modelu v Compound Discoverer zrychlila návrh struktur a lokalizaci modifikací.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje robustní nástroj pro QA/QC v biopharmaceutickém průmyslu. Umožňuje rychlé srovnání kvality surovin od různých dodavatelů, sledování kritických a ne-kritických nečistot a podporuje rozhodování o optimalizaci syntetických procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další automatizace interpretace spekter pomocí strojového učení.
• Rozšíření na další typy chemických modifikací oligonukleotidů.
• Integrace do běžných výrobních monitorovacích protokolů a regulatorních dokumentů.
• Vylepšení predikce fragmentace a využití AI při návrhu transformačních modelů.

Závěr

Kombinace Vanquish Horizon UHPLC a Orbitrap Exploris 120 s pokročilým softwarovým zpracováním poskytuje vysokou citlivost a přesnost pro identifikaci a strukturální objasnění stopových nečistot ve fosforamiditových materiálech. Metoda přispívá k lepší kontrole kvality a jednotnosti surovin pro syntézu terapeutických oligonukleotidů.

Reference

1. Beigel, J. et al. Synthesis of DNA/RNA Analogs via Phosphoramidite and H-Phosphonate Chemistry. Molecules 2013, 18, 14268–14284.
2. Kiesman, W. F. et al. Perspectives on the Design of Oligonucleotide Starting Materials. Nucleic Acid Therapeutics 2021, 31, 93–113.
3. ICH Q3A(R): Impurities in New Drug Substances, 2003.
4. Hackbusch, S. et al. LC/UV/HRAM-MS-based impurity profiling and structure elucidation of phosphoramidite raw materials. Thermo Fisher Scientific Application Note 001949, 2023.