Confident and sensitive profiling of lipid nanoparticle raw materials and impurity identification using a LC/CAD/HRAM-MS method with inverse gradient

Význam tématu

V posledních letech se lipidové nanočástice (LNP) staly nepostradatelným nosičem mRNA vakcín a genových terapií. Kvalita a čistota surovin použitých pro výrobu LNP zásadně ovlivňuje jejich stabilitu, účinnost i bezpečnost. Regulátoři proto požadují pečlivé sledování obsahu a identifikaci případných nečistot, zejména u nechromoforických lipidů, které vyžadují alternativní detekční techniky.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem předložené aplikace bylo předvést kombinované využití Vanquish Inverse Gradient LC s Charged Aerosol Detection (CAD) a vysokorozlišující Orbitrap Exploris 120 MS pro citlivou kvantifikaci a identifikaci nečistot ve dvou klíčových LNP surovinách – DC-Chol a DSPE-mPEG. Studie ukazuje:

• detekci a kvantifikaci hlavních surovin a spojených nečistot
• využití MS2 fragmentace a softwaru Compound Discoverer pro strukturální objasnění
• charakterizaci polydisperzity PEG-ylovaného lipidu

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky DC-Chol (čtyři dodavatelé, 95–98+% čistota) a DSPE-mPEG (jeden dodavatel, 98+% čistota) byly připraveny v ethanolu (1 mg/mL). Separace proběhla na systému Thermo Scientific Vanquish Inverse Gradient LC se třemi pumpami, kolonou Hypersil GOLD C8 (2,1 × 50 mm, 1,9 µm) a CAD detektorem. Inverse gradient optimalizoval organické složení v CAD pánvi pro rovnoměrnou citlivost. MS data získal Orbitrap Exploris 120 s OptaMax NG ESI zdrojem v režimu Full MS/ddMS2. Pro zpracování sloužily Xcalibur, Chromeleon, Freestyle (Xtract dekonvoluce) a Compound Discoverer 3.3 (Expected Compounds, FISh anotace).

Hlavní výsledky a diskuse

DC-Chol: CAD chromatogram odhalil čtyři hlavní nečistoty (označené 1–4). HRAM-MS a MS2 umožnily určit jejich modifikace na DC nebo cholesterolové části:

• –H2 (desaturace) na cholesterolové nebo DC části (2 izomery)
• +CH2 a +CHCl modifikace na kvaterním amoniu nebo karbamoylovém dusíku
• oxidace (+O)

Pomocí ddMS2 FISh anotace a přesných fragmentů byla lokalizována pozice změn. Rozdíly ve složení nečistot mezi dodavateli poukazují na variabilitu kvality surovin.
DSPE-mPEG: CAD trace neukázal významné nečistoty. Díky multiplitým aduktům (+NH4) a Xtract dekonvoluci byla určena distribuce molekulových hmotností podle počtu PEG jednotek (Gaussovo rozdělení). Nejhojnější izomer s 44 PEG jednotkami (m/z 2742,74 Da) podpořilo MS2 fragmentační spektrum charakteristickou stopou distearoylglyceridu (m/z 607,6).

Přínosy a praktické využití metody

• Spolehlivá kvantifikace nechromoforických lipidů pomocí CAD se sjednocenou odpovědí nezávislou na struktuře
• Vysoké rozlišení MS a MS2 fragmen­tační data pro rychlou identifikaci a lokalizaci nečistot
• Automatizované workflow v Compound Discoverer pro cílené i necílené vyhledávání derivátů
• Schopnost odhalit skryté, nízkoúrovňové impurity koelutující s hlavním vrcholem
• Analýza polydisperzity PEG-ylovaných lipidů klíčová pro kontrolu velikosti a stability LNP

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj dál povede k vyšší automatizaci a throughputu, včetně integrovaných softwarových řešení pro hloubkovou data mining analýzu a predikci možných degradací. Rozšíření aplikace na další třídy LNP lipidů, kombinace s IM-MS (ion mobility) a multimodálními detekcemi (UV, fluorescence) zlepší komplexní profilaci. S nárůstem objemů mRNA vakcín a genových terapií poroste požadavek na validované CMC metody splňující přísné regulační standardy.

Závěr

Kombinace Vanquish Inverse Gradient LC/CAD s Orbitrap Exploris HRAM-MS nabízí vysoce citlivé a spolehlivé řešení pro profilaci a strukturální identifikaci nečistot v LNP surovinách. Metoda poskytuje jak kvantitativní CAD data, tak kvalitativní MS/MS informace potřebné pro CMC a QC kontrolu surovin pro mRNA vakcíny a genové terapie.

Reference

1. World Health Organization. Technical Report Series No 1039, Annex 3: Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations; 2021.
2. Hou X et al. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6:1078–1094. doi:10.1038/s41578-021-00358-0.
3. Hald Albertsen C et al. The role of lipid components in lipid nanoparticles for vaccines and gene therapy. Adv Drug Deliv Rev. 2022;188:114416. doi:10.1016/j.addr.2022.114416.
4. White S, Hackbusch S, Du M. Profiling raw material impurities of the lipid nanoparticle components. Thermo Fisher Scientific Application Note 001342; 2022.
5. Menz M et al. Charged aerosol detection – factors affecting uniform analyte response. Thermo Fisher Scientific Technical Note 72806; 2021.
6. Comstock K, Du M. Impurity profiling of mycophenolate mofetil using Orbitrap Exploris 120 MS and Vanquish UHPLC with Compound Discoverer 3.3. Thermo Fisher Scientific Application Note 000531; 2022.