Raw Material Testing: Developing Methods for Quality Control of Phosphoramidites used in the Chemical Synthesis of Oligonucleotides

Význam tématu

Vysoce čisté phosphoramidity představují základní surovinu pro chemickou syntézu oligonukleotidů. I nízké hladiny nečistot se mohou při opakovaných cyklech dodávání monomerů kumulovat, což ohrožuje jak kvalitu finálního produktu, tak robustnost výrobního procesu. Systematické ověřování identity a čistoty phosphoramiditů je proto nezbytné pro zajištění konzistentní výroby a splnění regulačních požadavků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované práce bylo vyvinout jednotný a compliance-ready LC-UV-MS protokol pro testování identity a purity phosphoramiditů využívaných při automatizované syntéze oligonukleotidů. Studie hodnotí metodický přístup v souladu s doporučeními ICH Q11 a adaptuje požadavky na testovací metody definované v literatuře. Demonstrace využití Empower 3 CDS a kvadrupólového detektoru ACQUITY QDa doplňuje tradiční LC-UV analýzu o rychlé potvrzení hmotnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky phosphoramiditů byly připraveny v 0,01 % triethylaminu v suchém acetonitrilu při koncentracích 0,001–1 mg/mL. Pro chromatografii byla zvolena reverzní fáze s gradientem 10 mM (pH 9) amonného hydrogenuhličitanu a acetonitrilu. Teplota kolony 24 °C, teplota autosampleru 10 °C, injekční objem 3,3 µL. Metoda umožňuje současné sledování diastereomerů a oxidačních produktů P(III) z UV a hmotnostních dat.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary System
• ACQUITY UPLC Tunable UV Detector (237 nm)
• ACQUITY UPLC BEH C18 Column, 1,7 µm, 2,1×150 mm
• ACQUITY QDa Mass Detector (ESI+, 150–1250 m/z)
• Empower 3 Chromatography Data Software FR4

Hlavní výsledky a diskuse

• Identifikace tří phosphoramiditů dG, dA a 2′F-dA prokázala shodu monoisotopické hmoty v limitu ±1 amu.
• Sledování oxidace ukázalo nárůst oxidovaných frakcí z 1,14 % na 5,48 % při 40 injekcích ze stejného vzorku.
• Vyšší koncentrace vzorku (0,1–1 mg/mL) a použití samostatných vial snížily oxidaci pod 1 % u čerstvých příprav.
• Citlivostní standard při LOQ 0,05 % vykázal 78 % obnovu, area precision referenčního standardu 0,4 % RSD, vzorky se pohybovaly kolem 94 % rozsahu.

Přínosy a praktické využití metody

• Integrovaný LC-UV-MS protokol pokrývá jak potvrzení identity, tak kvantifikaci purity a oxidace surovin.
• Workflow v Empower 3 CDS je připravené pro auditní účely a splňuje regulační požadavky ICH.
• Metoda podporuje rychlou kontrolu kvality vstupních surovin před vlastní oligonukleotidovou syntézou, čímž zvyšuje efektivitu výroby.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další výzkum může zkoumat zdroje oxidace a degradace phosphoramiditů, včetně přidávání redukčních činidel nebo pasivačních postupů LC systému. Rozšíření metody o vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrii by umožnilo detailní profilaci a charakterizaci nečistot. Integrace do plně automatizovaných GMP procesů a přenositelnost na různé typy monomerů představují klíčové směry pro budoucí implementaci.

Závěr

Popsaná LC-UV-MS metoda nabízí robustní a regulacím odpovídající přístup pro testování identity a purity phosphoramiditů. Optimalizace koncentrace vzorku a správa oxidace jsou zásadní pro přesné stanovení kvality surovin. Implementace citlivostních standardů zajišťuje spolehlivost metody při nízkých hladinách analyzovaných látek.

Reference

1. Kulkarni J. A.; Witzigmann D.; Thomson S. B.; Chen S.; Leavitt B. R.; Cullis P. R.; van der Meel R. The Current Landscape of Nucleic Acid Therapeutics. Nature Nanotechnology 2021, 16, 630–643.
2. Kiesman W. F.; McPherson A. K.; Diorazio L. J.; Van den Bergh L.; Smith P. D.; Northall J. M.; Fettes A.; Wang T.; Mehlmann M.; Raza S.; Held G. Perspectives on the Designation of Oligonucleotide Starting Materials. Nucleic Acid Therapeutics 2021, 31, 93–113.
3. ICH Q3(R2) Impurities in New Drug Substances; ICH Q11 Quality Guidelines. International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, 2022.
4. Hargreaves J. S.; Kaiser R.; Wolber P. K. The Degradation of dG Phosphoramidites in Solution. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 2015, 34, 691–707.