Accelerating Oligonucleotide Research Using Novel Bioinert LC, QTOF and TQ LC-MS

Význam tématu

Oligonukleotidové terapeutika představují moderní třídu léčiv, která přímo zasahují do genetické informace a nabízejí možnost přesného zásahu do patofyziologie různých onemocnění. Klíčovým předpokladem úspěšného vývoje a nasazení těchto látek je spolehlivá analýza jejich chemické čistoty, správné sekvence a stabilní kvantifikace. Použití bioinertních kapalinových chromatografických systémů v kombinaci s hmotnostní spektrometrií výrazně zvyšuje přesnost, citlivost a reprodukovatelnost výsledků, což je nezbytné pro kontrolu kvality i výzkumné aplikace.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat využití bioinertního UHPLC systému Nexera XS a sloupců odolných vůči kovům pro IEC a RP separaci oligonukleotidů spolu s analýzou pomocí Q-TOF (LCMS-9030) a triple quadrupole (LCMS-8060) hmotnostní spektrometrie. Konkrétně se sledovalo:

• Oddělení syntetického oligonukleotidu od vedlejších produktů a nečistot pomocí iontové výměnné chromatografie.
• Stanovení molekulové hmotnosti a charakterizace 2’-MOE modifikovaného oligonukleotidu (20 bází) s přesností do 0,05 ppm.
• Kvantitativní analýza v režimu multiple reaction monitoring (MRM) v rozsahu 1–1000 ng/mL.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Syntetizované jednovláknové DNA očistěné HPLC, rozpuštěné v Milli-Q vodě na 5 μmol/L.
• Oligonukleotidové žebříčky (10–60 bází) připravené v mobilní fázi.

Chromatografie:

• Ion Exchange Chromatography: Shim-pack Bio IEX; mobilní fáze s pH kontrolou, filtr na láhvi potlačující odpar a změny pH.
• Reversed-Phase IP-RP: Shim-pack Scepter C18; binární gradient metanol/voda s 2 mM formiátu amonného a 0,002 % kyseliny mravenčí.
• UHPLC kolona: Shim-pack Velox 2,1×100 mm, 2,7 μm; průtok 0,3 mL/min, doba běhu 17 min.

Hmotnostní spektrometrie:

• QTOF LCMS-9030 pro vysoce přesnou měřenou hmotnost (přesnost <3 mDa).
• Triple quadrupole LCMS-8060 pro kvantifikaci MRM módem (prekurzor m/z 803,4626; produkt m/z 94,9358).

Hlavní výsledky a diskuse

Iontová výměnná chromatografie na bioinertní cestě minimalizovala adsorpci kovů a vedla k vynikající linearitě kalibrační křivky (r2 = 0,9999) i při nízkých koncentracích QC. Filtry na uzávěrech lahví zabránily změnám pH a zajišťovaly stabilní retence. QTOF analýza potvrdila přesnou molekulovou hmotnost 2’-MOE oligonukleotidu s odchylkou 0,05 ppm. MRM režim trojitého kvadrupólu umožnil citlivou kvantifikaci v rozsahu 1–1000 ng/mL s vysokou opakovatelností.

Přínosy a praktické využití metody

Tato kombinace bioinertní chromatografie a vysoce výkonné MS poskytuje:

• Robustní kontrolu kvality oligonukleotidových produktů.
• Rychlejší vývoj a validaci nových terapeutik.
• Možnost detekce i stopových nečistot s vysokou reprodukovatelností.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj bioinertních materiálů pro minimalizaci adsorpce, zlepšení DDS nosičů a integrace mikrofluidních systémů s hmotnostní spektrometrií. Rovněž vývoj automatizovaných workflow pro vysokoprůtokový screening a real-time monitoring stability oligonukleotidů.

Závěr

Použití bioinertního UHPLC systému a pokročilých MS technologií zásadně zlepšuje přesnost, citlivost a spolehlivost analýzy oligonukleotidů. Metodika je vhodná pro vývoj, kontrolu kvality i výzkum nových geneticky cílených léčiv.

Reference

• Mandal M., Domanski B., Xia X., Mittal N. Accelerating Oligonucleotide Research Using Novel Bioinert LC, QTOF and TQ LC-MS. Shimadzu Scientific Instruments.