Measurement of Oligonucleotide Impurities Using Shimadzu Nexera XS Inert Coupled To LCMS-9030 QTOF

Význam tématu

Rozvoj oligonukleotidových terapeutik, jako jsou antisense oligonukleotidy a siRNA, vyžaduje přesné stanovení nečistot pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti produktů. HRMS je klíčová technika pro detekci a kvantifikaci nežádoucích vedlejších produktů syntézy, degradace či chemických modifikací.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie je představit end-to-end workflow pro kvantifikaci nečistot v 20-mer antisense oligonukleotidu Tofersen, zahrnující přídavek 5 % 19-mer n-1 impurity do hlavního produktu (FLP) a následnou analýzu bioinertní UHPLC-HRMS.

Použitá metodika

Popis postupu:

• Příprava vzorku: 5 % 19-mer n-1 impurity spikováno do 20 µM FLP, ředěno v nuclease-free vodě a vloženo do bioinertních TORAST-H Bio vialek.
• UHPLC: Shim-pack Scepter Claris C18-300 (2.1×100 mm, 1.9 µm), gradientní eluce 5–60 % methanolu v 20 min, tok 0.3 mL/min, teplota kolony 60 °C.
• ESI-HRMS: Heated ESI 4.5 kV, interface 350 °C, DL 25 °C, heat block 350 °C, plyny nebulizace 2 L/min, ohřev 10 L/min, sušení 10 L/min. DDA negativní režim, rozsah TOF m/z 700–2200.

Použitá instrumentace

• Shimadzu Nexera XS Inert UHPLC
• Shimadzu LCMS-9030 QTOF
• Software LabSolutions Insight Biologics
• Shim-pack Scepter Claris C18-300 kolona

Hlavní výsledky a diskuse

Software automaticky dekonvoluuje spektra a zobrazuje poměr impurit vůči FLP. Impurita 19-mer byla kvantifikována na 4.3–4.6 % oblasti FLP. Recovery se pohybovala mezi 84.4 a 92.6 %, v souladu s požadavky 80–120 %. Repetabilita a mezidenní přesnost byly pod 5 % RSD, splňující pokyny ICH Q2 (R2).

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní workflow pro rychlou charakterizaci a kvantifikaci oligonukleotidových nečistot.
• Automatizovaná interpretace MS a MS2 dat včetně pokrytí sekvence v režimech fill a branch.
• Splnění regulatorních požadavků pro biopharma QA/QC procesy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na různé chemické modifikace a délky oligonukleotidů.
• Automatizace přípravy vzorků a vysokopropustná data pipeline.
• Integrace pokročilé bioinformatiky pro detailní analyzu fragmentačních dat.

Závěr

Bioinertní UHPLC spojená s HRMS a specializovaným softwarem tvoří robustní platformu pro analýzu oligonukleotidových nečistot. Workflow splňuje ICH Q2 (R2) požadavky a nabízí vysokou přesnost, reprodukovatelnost a efektivitu.

Reference

• 01-00595-EN An Oligonucleotide Impurity Analysis Workflow Using LabSolutions Insight Biologics software, Shimadzu.
• Sutton JM, Guimaraes GJ, Annavarapu V, van Dongen WD, Bartlett MG. Current State of Oligonucleotide Characterization Using Liquid Chromatography−Mass Spectrometry: Insight into Critical Issues. J Am Soc Mass Spectrom. 2020;31:1775–1782.