Fluorescence measurement of hybridization between quencher (DABCYL) labelled PNA probes and a fluoresceine labelled DNA using the Fluorescence BioMelt Package

Význam tématu

Reverzibilní hybridizace nukleových kyselin je základem procesů jako replikace, transkripce a translace v živých buňkách. V analytické praxi umožňuje rychlou a citlivou detekci specifických sekvencí DNA nebo RNA, a to i při nízkých koncentracích vzorku. Použití peptid-nukleových kyselin (PNA) s vysokou afinitou a odolností vůči enzymatické degradaci dále zvyšuje robustnost hybridizačních testů.

Cíle a přehled studie

Cílem předkládané studie bylo porovnat termální stabilitu komplexů PNA–DNA pomocí fluorescenčního značení a měření teploty tání (Tm). Analyzovány byly dva PNA sondy odlišné délky (9mer a 13mer) značené neluminiscenčním quenchrem DABCYL a komplementární DNA značená fluoresceinem.

Použitá metodika a instrumentace

Pro termální fluorescenční měření byl využit systém Fluorescence BioMelt Package:

• Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer
• Multicell Peltier s regulátorem teploty
• Quartzové kyvety 10 mm
• Eclipse Thermal Software (Bio software pack)

Vzorky PNA a DNA byly připraveny v pufru (100 mM NaCl, 10 mM KPO4, pH 7,1) při koncentraci 50 nM každé složky. Měření probíhalo v rozmezí 20–95 °C a zpět s rampou 0,5 °C/min a pětiminutovými pauzami na každé extrémní teplotě.

Hlavní výsledky a diskuse

Měření prokázala výrazný rozdíl ve Tm hodnotách obou sond: 9mer PNA–DNA komplex měl Tm = 49,9 °C, zatímco 13mer dosáhl Tm = 63,9 °C. Delší PNA s vyšším počtem polyaminových vazeb vykazuje silnější interakci s komplementární DNA, což se projeví vyšší energetickou náročností na oddělení vláken při zahřívání.
Výsledky potvrzují, že délka PNA sondy přímo ovlivňuje termodynamickou stabilitu hybridního komplexu. Efektivní teplotní kontrolu a reprodukovatelnost zajišťuje použitý multicell Peltier a přesné softwarové řízení ramp.

Přínosy a praktické využití metody

• Citlivá detekce specifických nukleotidových sekvencí s nízkými koncentracemi vzorku.
• Rychlá optimalizace podmínek hybridizace díky termodynamickým výpočtům ΔH, ΔS, ΔG a konstantám rychlosti přímo v softwaru.
• Vysoká stabilita a odolnost PNA sond proti nukleázám a proteázám zjednodušuje práci v biologických matricích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření PNA technologií do oblastí multiplexních testů pro potravinářskou a environmentální mikrobiologii, diagnostiky onemocnění a vývoje cílených antisense terapií. Dále lze kombinovat FRET přístupy se senzory pro in situ monitoring hybridizace v buněčných kultivacích nebo aplikovat ultrarychlé rampy pro vysokoprůtokové screeningové platformy.

Závěr

Studie ukázala, že délka PNA sondy zásadně ovlivňuje termální stabilitu hybridního komplexu s fluoresceinem značenou DNA. Využití BioMelt systému s integrovanou teplotní regulací a softwarovou analýzou nabízí praktický nástroj pro rychlé stanovení optimálních podmínek hybridizace a návrh citlivých molekulárně-biologických testů.

Reference

• Plum G.E. et al. Annu. Rev. Biomol. Struct. 1995.
• www.bostonprobes.com
• Guzzo-Pernell N., Tregear G.W. Aust. J. Chem. 2000.
• Guzzo-Pernell N. et al. Biomed. Peptides Proteins Nucleic Acids 1997.
• Yang M. et al. Biochemistry 1994.
• Goforth S. The Scientist 2000.
• Marky L.A., Breslauer K.J. Biopolymers 1987.
• Morrison L.E., Stols L.M. Biochemistry 1993.
• Breslauer K.J. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology 1986.
• Bush C.A. Basic Principles in Nucleic Acid Chemistry 1974.
• Patel D.J. et al. Science 1982.
• Clegg R.M. Methods in Enzymology 1992.
• Yaron A. et al. Anal. Biochemistry 1972.
• Fiandaca M.J. et al. Genome Research 2001.
• Hoffman-La Roche on PCR.
• Agilent Technologies Application Note SI-A-1833, 2011.