Fast Determination of Thermal Melt Temperature of Double-Stranded Nucleic Acids by UV-Vis Spectroscopy

Význam tématu

Tepelné denaturace dvouřetězcových nukleových kyselin slouží k identifikaci složení bází, kontrole kvality při vývoji léčiv a výzkumu. Metoda využívá zvýšenou absorpci při 260 nm u jednovláknové formy a poskytuje informaci o poměru GΞC a A=T/U.

Cíle a přehled studie

Studie hodnotila vliv šesti různých rychlostí teplotního gradientu (1, 5, 10, 20, 30 a 40 °C/min) na naměřené teploty tání (Tm) herring sperm DNA pomocí spektrofotometru Agilent Cary 3500 Multizone UV-Vis.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: roztok DNA (~15 µg/ml) v fosfátovém pufru (pH 7,4).
• Instrumentace: Agilent Cary 3500 Multizone UV-Vis se zabudovanými Peltier moduly a osmi pozicemi pro kyvety.
• Kyvety: křemenné semimikro s teplotním čidlem, objem 600 µl, optická délka 10 mm, minerální olej zabránil odparu.
• Měřicí parametry: detekce při 260 nm, průměrování signálu 0,1 s, sběr každého 1 °C.
• Rampové rychlosti: 1, 5, 10, 20, 30, 40 °C/min; data analyzována pomocí Savitzky–Golayovy filtrace a první derivace.

Hlavní výsledky a diskuse

Pro všechny rychlosti gradientu se naměřená Tm pohybovala kolem 86,9 °C s maximální odchylkou ±0,2 °C. Experimentální doba byla snížena z 2,5 hodiny (0,5 °C/min) na přibližně 10 minut při 30 °C/min bez ztráty reprodukovatelnosti.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy a zvýšení průchodnosti laboratoří.
• Zachování vysoké přesnosti a reprodukovatelnosti výsledků i při rychlém zahřívání.
• Vhodné pro QC testy, vývoj a validaci biotechnologických procesů i vysokoproduktové aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace s laboratorními informačními systémy a softwarem pro dodržování regulačních požadavků, rozšíření na měření RNA a dalších biopolymérů, real-time sledování procesů a masivní škálování pro vysokoproduktovou analýzu.

Závěr

Agilent Cary 3500 Multizone UV-Vis umožňuje rychlé, spolehlivé a reprodukovatelné stanovení teploty tání nukleových kyselin při odlišných rampových rychlostech, čímž významně zkracuje dobu experimentu bez kompromisu na kvalitě dat. Vestavěné funkce filtrace a derivace v softwaru rychle poskytují výsledky.

Reference

1. Shen C-H. Diagnostic Molecular Biology Detection and Analysis of Nucleic Acids; Academic Press 2019 s. 167–185.
2. Chetana P R et al. New Ternary Copper(II) Complexes of L-Alanine and Heterocyclic Bases DNA Binding and Oxidative DNA Cleavage Activity Inorganica Chimica Acta 2009 362 4692–4698.
3. Rao R Patra A K Chetana P R Synthesis Structure DNA Binding and Oxidative Cleavage Activity of Ternary (L-leucine/isoleucine) Copper(II) Complexes of Heterocyclic Bases Polyhedron 2008 27 1343–1352.
4. Davis T M et al. Melting of a DNA Hairpin Without Hyperchromism Biochemistry 1998 37(19) 6975–6978.
5. Savitzky A Golay M J E Smoothing and Differentiation of Data by Simplified Least Squares Procedure Analytical Chemistry 1964 36 1627–1639.