Evaluation of Comprehensive Quantification Assays for Plasma Protein Analysis Using a Novel Triple Quadrupole LC/MS

Význam tématu

Cílená multiplexní kvantifikace proteinů pomocí triple kvadrupólu LC/MS se stává stále důležitější metodou v proteomické analýze biomedicínských vzorků. Plazma z člověka i modelových organismů představuje kritickou matrici pro objevování a validaci biomarkerů, avšak její komplexita a široký dynamický rozsah koncentrací proteinů vyžadují vysoce citlivé a robustní nástroje. Propojení výkonného chromatografického rozdělení s selektivní detekcí pomocí MRM (multiple reaction monitoring) umožňuje přesné stanovení nízkých úrovní cílených peptidů v rušivém pozadí plazmatických bílkovin.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat a otestovat nové 6495 triple kvadrupólové LC/MS (G6495D) s generaci iFunnel a automatizacemi proti jeho předchůdci v analýze velkých panelů peptidů v lidské a myší plazmě. Studie zahrnovala:

• Vyhodnocení zvýšení MRM signálů
• Ověření analytické citlivosti a lineárního rozsahu
• Testy velkého panelu 375 proteinů na myší plazmě během více dní měření

Použitá metodika a instrumentace

Analýzy byly provedeny na soustavě Agilent 1290 Infinity II Bio LC spojené s 6495 Triple Quadrupole LC/MS (G6495D) a zdrojem AJS s technologií Jet Stream. Klíčové parametry LC:

• Kolona: Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, 2,1 × 150 mm, 1,8 µm
• Teplota chladiče vzorkovače: 4 °C; průtok: 0,4 mL/min; injekce: 10 µL
• Mobilní fáze: A) voda + 0,1 % kyselina mravenčí, B) acetonitril + 0,1 % kyselina mravenčí; gradient 2→30 % B v 50 min

MS parametry:

• Ionizace: AJS v pozitivním režimu; sušící plyn 17 L/min při 150 °C; mlžný plyn 30 psi; plášťový plyn 12 L/min při 250 °C; kapilární napětí 3 500 V
• MassHunter 12.1 a Skyline pro optimalizaci metod a kvantifikaci

Hlavní výsledky a diskuse

• Zvýšení MRM odezvy o 2–3násobek oproti předchůdci díky iFunnel a optimalizovanému cyklu akvizice.
• Citlivost pro modelový peptid ATEHLSTLSEK demonstrovala vynikající linearitu (R2 = 0,9996) v rozmezí 1 amol/µL až 50 fmol/µL, s přesností lepší než 15 % při úrovních do 50 amol/µL.
• Signál/šum pro nízké nálože dosahoval hodnot až 155 (10 amol), s relativní odchylkou CV < 12 %.
• Při měření panelu 375 proteinů v 56 vzorcích myší plazmy bylo dosaženo:

• 2 250 tranzicí v dMRM, až 204 souběžných MRM, cyklus 650 ms
• Průměrný dohmatný čas (dwell) většiny peptidů < 4 ms
• Dynamický rozsah signálů přes 6 řádů
• Střední CV normalizovaných ploch 4,9 %, 100 % CV < 20 % (QC injekce n = 9)

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a selektivita pro cílenou kvantifikaci biomarkerů v komplexní matrici plazmy
• Možnost aplikace rozsáhlých multiplexních panelů pro rychlou a reprodukovatelnou analýzu
• Integrovaná automatizace a optimalizace šetří čas při vývoji a validaci metod

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dále rozšiřovat multiplexní kapacitu pro stovky až tisíce peptidů
• Integrace s imunoprecipitačními postupy pro lepší obohacení cílených proteinů
• Implementace pokročilých datových platforem pro automatizované zpracování a reporting
• Aplikace v klinické diagnostice, farmakokinetice a toxikologii

Závěr

Nový Agilent 6495 LC/TQ (G6495D) prokázal významné zlepšení v citlivosti, selektivitě i reprodukovatelnosti kvantifikace peptidů v komplexní biomatrici. Díky automatizovaným postupům a vylepšené hardwarové výbavě je metoda vhodná pro náročné aplikace v proteomice a klinickém výzkumu.

Reference

1. Wu L., Li G., Batoon P. Evaluation of Comprehensive Quantification Assays for Plasma Protein Analysis Using a Novel Triple Quadrupole LC/MS. ASMS 2023, Poster MP 051.
2. MRM Proteomics Inc. PeptiQuant Plus Kits for Human and Mouse Plasma Protein Analysis.
3. Agilent Technologies. Agilent 1290 Infinity II Bio LC and 6495 Triple Quadrupole LC/MS System Documentation.