Quantitative Targeted Proteomics of Mouse Plasma Protein Biomarkers by using Nano LC coupled to Triple Quadrupole Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza krevních proteinů má klíčový význam pro diagnostiku, monitorování léčby a výzkum onemocnění. Díky velké variabilitě a rozsahu koncentrací proteinů v plazmě vyžaduje vývoj cílených analytických metod vysokou citlivost, přesnost, rychlost a robustnost. Metody založené na nano-LC a triplekvadupólové hmotnostní spektrometrii umožňují kvantifikovat stovky biomarkerů v jediném běhu, což otevírá cestu k vysoce výkonným klinickým testům.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo demonstrovat schopnost kvantitativní analýzy 375 myších plazmatických proteinů v jednom analytickém běhu pomocí nano-LC Evosep One spojeného s Agilent 6495C triple kvadruple mass spektrometrem. Autoři testovali rychlý režim (30 SPD/44 min) s dynamickým MRM sledováním 2250 přechodů a posuzovali citlivost, linearitu, přesnost a opakovatelnost metody.

Použitá metodika

Vzorky byly připraveny pomocí komerčního PeptiQuant Plus kitu. BSA sloužil jako matrice pro kalibrační křivku. Proteiny byly redukovány DTT, alkylovány iodoacetamidem a tráveny trypsinem. Do vzorků byly přidány stabilně značené izotopové interní standardy. Peptidy byly zachyceny na Evotipu a chromatograficky separovány v Evosep One nano-LC systému, poté analyzovány v 6495C QQQ MS v režimu dynamického MRM.

Použitá instrumentace

• Chromatografie: Evosep One s EV1106 kolonkou a EV1117 emitorem
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6495C triple kvadruple QQQ
• Softwarové nástroje: Skyline a Agilent Quantitative Analysis

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila detekci 750 peptidů (375 lehkých a 375 označených) s LLOQ pod 100 amol/µL pro více než 85 % analyzovaných peptidů, což představuje desetinásobné zlepšení oproti standardnímu UHPLC postupu. Dynamický MRM režim s nejkratším dwell time 1,2 ms zvládl monitorování 2250 přechodů během jednoho běhu. Linearita měření přesahovala čtyři řády koncentrací, s vynikající intradenní i mezidení přesností (CV < 10 %) a přesností odchylky (bias < 15 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká analytická citlivost a nízké kvantifikační limity umožňují detekci nízkokoncentrovaných biomarkerů.
• Rychlý analytický běh (44 minut) zvyšuje průchodnost laboratoře a snižuje náklady na analýzu.
• Robustní a snadno automatizovatelný workflow podporuje rutinní nasazení v klinických i výzkumných laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšiřování počtu analyzovaných biomarkerů díky optimalizaci MRM přechodů a další zkracování analytických běhů. Kombinace s novými nano-LC systémy a pokročilými datovými algoritmy pro zpracování výsledků umožní ještě vyšší citlivost, integraci do klinické praxe a podporu personalizované medicíny. Možnosti multiplexního sledování více panelů a automatizace přípravy vzorků otevřou cestu k rutinním screeningovým testům.

Závěr

Prezentovaná nano-LC–QQQ MS metoda s dynamickým MRM dokázala kvantifikovat 375 myších plazmatických proteinů v jediném 44minutovém běhu s vynikající citlivostí, linearitou a opakovatelností. To potvrzuje potenciál této technologie pro nasazení v klinických a výzkumných aplikacích zaměřených na biomarkery v krevních vzorcích.

Reference

1. Bache N. et al. A Novel LC System Embeds Analytes in Pre-formed Gradients for Rapid, Ultra-robust Proteomics. Mol. Cell Proteomics 2018, 17(11), 2284–2296.