Robust and Reproducible Protein Quantification in Plasma using Evosep One and Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/MS

Význam tématu

V klinickém výzkumu je kvantifikace nízkoodstupňových proteinových biomarkerů v plazmě klíčová pro diagnostiku a sledování onemocnění. Požadavky na vysokou citlivost, robustnost a propustnost analytického systému vedly k vývoji nových LC/MS řešení, která kombinují rychlost standardního průtokového chromatografu s citem nanoflow systémů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit robustnost, reprodukovatelnost a analytickou citlivost nízkoprůtokového systému Evosep One spojeného s Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/MS při množení komplexního vzorku lidské plazmy. Studie porovnala opakovatelné průběhy chromatografie, stabilitu signálu MRM a linearitu standardních křivek před a po dlouhodobém zatížení systému.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky:

• Denaturace, redukce, alkylace a trypsinová digesce lidské plazmy
• Lyofilizace, rehydratace a přimíchání stabilně izotopově značených (SIS) standardních peptidů
• Nakládání přibližně 1 µg digestu na Evotip bez další SPE úpravy

Instrumentace:

• Evosep One (EV1000) s předformovanou gradientní metodou 21 min
• Analytický sloupec C18 8 cm × 100 µm, průtok 1 µL/min, propustnost až 60 vzorků/den
• Agilent Nanospray zdroj (G1992A) s ocelovým emitterem
• Agilent 6495 Triple Quadrupole (G6495B) v režimu dMRM, nastavení: nanoESI pozitivní ionizace, T = 200 °C, 11 L/min, 1750 V, Q1/Q3 rozlišení unit/unit, 198 MRMs
• Data zpracování: MassHunter Workstation v10.0 a Skyline v19.1

Hlavní výsledky a diskuse

Robustnost chromatografie:

• 574 po sobě jdoucích injekcí na jednom sloupci bez úprav zdroje nebo MS
• Relativní rozptyl retence (RT RSD) 0,43 – 2,75 %
• Stabilní zpětný tlak po celou dobu měření

Reprodukovatelnost signálu:

• Median RSD MRM plochy 8,5 %, 93,9 % peptidů pod 16 %
• Dva outliery způsobeny hydrofilní nestabilitou a interferencí matrice
• Čtyři referenční peptidy: RSD signálu 6,0 – 7,9 %, RT RSD 0,59 – 1,04 %

Standardní křivky:

• SIS peptid SGIPIVTSPYQIHFTK: LOD 4 amol, LLOQ 10 amol na kolonu
• Výsledné křivky před i po robustnostním testu prakticky identické (R² > 0,998)

Přínosy a praktické využití metody

Metoda kombinuje vysokou propustnost s výjimečnou stabilitou a citlivostí, což je vhodné pro kvantitativní proteomics ve velkých klinických kohortách. Jednoduchá příprava na Evotips a minimální údržba systému zkracují dobu mezi analýzami.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelů biomarkerů pro multiplexní kvantifikaci
• Automatizace čisté přípravy vzorků a integrace s robotickými stanicemi
• Implementace pokročilých algoritmů pro real-time monitoring a korekci driftu
• Propojení s klinickými informačními systémy pro efektivní správu dat

Závěr

Systém Evosep One v kombinaci s Agilent 6495 TQ LC/MS prokázal vynikající reproducibilitu, robustnost a citlivost pro kvantitativní analýzu proteinů v plazmě. Umožňuje spolehlivé dlouhodobé nasazení v prostředí klinického výzkumu a průmyslové QC.