Peptide Quantification in Plasma Using the Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/MS Coupled with the Agilent 1290 Infinity II LC System

Význam tématu

Tranzlační výzkum a klinické studie vyžadují citlivé a robustní metody pro kvantifikaci proteinových biomarkerů v komplexních matricích, jako je lidská plasmatická hmota. Vysoký průtok, reprodukovatelnost a opakovatelnost jsou klíčové ve velkých kohortách. Standard-flow LC/TQ systémy, jako Agilent 6495 s triple kvadrupolem a Agilent 1290 Infinity II LC, jsou osvědčené platformy pro MRM analýzu peptidů v komplexních vzorcích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat kvantitativní výkon MRM-založené LC/MS analýzy 99 peptidů z 75 proteinových biomarkerů v lidské plasmě. K hodnocení citlivosti, linearity a přesnosti bylo využito devět koncentrací stable isotope-labeled peptide (SIS) od 5 amol/μL do 100 fmol/μL v plasmové matrici. Analýza proběhla na systému Agilent 1290 Infinity II LC a Agilent 6495 triple kvadrupole LC/MS s Jet Stream ionizací.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace:
  
  • Agilent 1290 Infinity II LC systém (High Speed Pump, Multisampler s chlazením, Thermostatted Column Compartment)
  • Agilent Jet Stream ionizační zdroj
  • Agilent 6495C triple kvadrupól LC/MS
• Chromatografie:
  
  • Kolona ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 (2,1×150 mm, 1,8 μm)
  • Gradient 0,1 % HCOOH ve vodě (A) a acetonitrilu (B), 0,4 mL/min, 43 min, 50 °C
• Příprava vzorku:
  
  • Ředění plasmy, denaturace TFE, redukce DTT, alkylační IAA
  • Trypsinová digesce při 37 °C
    
  • Sušení, rehydratace na 1 μg/μL, přídavek SIS peptidů ve 9 koncentracích
• Získávání a zpracování dat:
  
  • Dynamic MRM režim v MassHunter
  • Optimalizace retence a AJS parametrů
  • Kvantifikace v MassHunter Quantitative Analysis v10.1

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografie:
  
  • Výborné rozlišení a stabilita retence (medián FWHM 3,5 s; RSD retence 0,13 %)
• Sensitivita a linearita:
  
  • Lineární rozsah s R2 ≥ 0,99 pro 80 % z cílených peptidů
  • LLOQ až 5 amol/μL v plasmové matrici pro vybrané peptidy
• Přesnost a opakovatelnost:
  
  • RSD < 20 % a přesnost 80–120 % (např. peptid AFLLTPR v rozmezí 5–100 fmol/μL)
• Matrikové interference:
  
  • Qualifier/quantifier poměry odhalily interference u peptidu SGIPIVTSPYQIHFTK, což posunulo jeho LLOQ na 10 amol/μL

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká průtokovost a robustnost vhodná pro rozsáhlé studie stovek až tisíců vzorků
• Možnost dosáhnout vysoké citlivosti bez specializovaných nízkoproudých systémů
• Jednoduchá údržba a reprodukovatelné výsledky v rutinních podmínkách

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření multiplexních panelů na stovky peptidů pro komplexní profilování biomarkerů
• Automatizace workflow ve výzkumu i klinické diagnostice
• Nasazení AI a strojového učení pro optimalizaci MRM přechodů a analýzu dat v reálném čase

Závěr

Standard-flow triple kvadrupol Agilent 6495 LC/MS v kombinaci s Agilent 1290 Infinity II LC a Jet Stream ionizací poskytuje vysoce citlivou, přesnou a reprodukovatelnou kvantifikaci peptidových biomarkerů v lidské plasmě. Díky robustnosti a snadné údržbě je metoda ideální pro rozsáhlé klinické a výzkumné aplikace.

Reference

• The Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/MS: Peptide Quantitation Performance. Agilent Technologies, 2016.
• Jet Stream Proteomics for Sensitive and Robust Standard Flow LC/MS. Agilent Technologies, 2015.
• Percy A.J. a kol. A Standardized Kit for Automated Quantitative Assessment of Candidate Protein Biomarkers in Human Plasma. Bioanalysis 2015, 7(23), 2991–3004.
• Robust and Reproducible Protein Quantification in Plasma using the Evosep One and the Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/MS. Agilent Technologies, 2020.