An Easier, More Robust, and Faster Low- flow Quantitative Proteomics Approach

Význam tématu

Targetovaná kvantitativní proteomika založená na vícečetném monitorování reakcí (MRM) představuje klíčový nástroj pro přesné stanovení hladin proteinů v komplexních biologických vzorcích. Nízkoprůtokové chromatografické systémy v kombinaci s rychlými QQQ hmotnostními spektrometry významně zvyšují citlivost, přesnost i robustnost analýzy při současném zkrácení doby měření a zjednodušení zpracování dat.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat novou konfiguraci vysokovýkonné LC/MS soustavy pro rychlou a spolehlivou kvantifikaci proteinů při nízkých průtocích. Autoři porovnali standardní 60minutovou metodu s metodami 60, 200 a 300 vzorků za den (SPD) na systémech Evosep One a Agilent 6495C LC/TQ.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmatického tryptického digestu byly připraveny s přídavkem stabilně izotopově značených standardních peptidů. Chromatografie probíhala na Evosep One HPLC systému se separacemi nastavenými na 60, 200 a 300 SPD (průtoky 1, 2 a 4 μl/min). Kvantifikace peptidů byla prováděna na triple kvadrupólovém hmotnostním spektrometru Agilent 6495C. Data byla zpracována v softwaru Skyline a Agilent Quantitative Analysis.

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda 60 SPD (21 minut): kvantifikace 125 peptidů s mezní relativní odchylkou (CV) ≤15 %, šířkou píku <3,6 s a doby cyklu pod 25 minut.
• Limity kvantifikace (LLOQ) dosahují až jednotek amol na kolonu, přičemž 28 % peptidů dosahuje CV <10 % a 8 % CV <5 %.
• Snížení doby pobytu (dwell time) až na 5 ms zachovává vysokoúrovňovou reprodukovatelnost (91 % peptidů <15 % RSD).
• Metody 200 a 300 SPD umožňují stanovení 20 peptidů (60 tranzic) v časech 5,6 a 3,2 minut s LLOQ <500 amol pro více než polovinu analyzovaných peptidů.
• Systém prokázal výjimečnou robustnost: opakovatelnost přes 1500 injekcí bez poklesu výkonu a minimální přenos mezi vzorky díky jednorázovým pastičkám a jednoduchým svárům.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená analytická citlivost a rozšířený lineární rozsah při nízkých průtocích.
• Krátké doby analýzy umožňují vysokou propustnost vzorků (až 300 SPD) vhodnou pro klinické studie a průmyslovou kontrolu kvality.
• Jednoduché a rychlé nastavení metody, minimalizace údržby díky robustní chromatografii.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zkracování doby analýzy při zachování citlivosti pro masivní biobankové studie.
• Integrace s automatizovanými pracovisky pro celopanelové proteomické kvantifikace.
• Širší využití v personalizované medicíně, farmakokinetice a validaci biomarkerů.

Závěr

Nová LC/MS konfigurace spojující Evosep One a Agilent 6495C LC/TQ přináší výrazné zlepšení v rychlosti, citlivosti, přesnosti i robustnosti MRM kvantifikace proteinů. Tento přístup je vhodný pro vysoce propustné aplikace v klinické a průmyslové proteomice.

Reference

• Bache N. et al. A Novel LC System Embeds Analytes in Pre-formed Gradients for Rapid, Ultra-robust Proteomics. Mol. Cell Proteomics 2018, 17(11), 2284–2296.