TIDES: AN AUTOMATED WORKFLOW FOR INTACT MASS, PURITY AND SEQUENCE CONFIRMATION OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES AND THEIR IMPURITIES

Význam tématu

V posledních letech se syntetické oligonukleotidy staly klíčovým nástrojem v léčbě i výzkumu, kdy nabízejí specifickou modulaci genové exprese jako alternativa k malým molekulám či proteinům.

Pro uvedení těchto terapeutik do praxe je zásadní spolehlivá kontrola kvality, zahrnující potvrzení hmotnosti, čistoty a sekvence až na úrovni stopových nečistot.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentovaného workflow je demonstrovat plně automatizovanou, compliance-ready metodu pro analýzu syntetických oligonukleotidů a jejich nečistot. Workflow kombinuje aplikace waters_connect INTACT Mass pro potvrzení intaktní hmotnosti a čistoty a CONFIRM Sequence pro ověření sekvence na základě MS/MS fragmentačního spektra.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci 21-mericého oligonukleotidu a jeho nečistot byla použita reverzně-fázová IP-RP chromatografie na systému BioAccord LC-MS vybaveném ACQUITY Premier UPLC s OST kolonnou.

• Mobilní fáze: 7 mM TEA/40 mM HFIP (A) a 3,5 mM TEA/20 mM HFIP v 50 % methanolu (B), gradient 25–35 % B/25 min.
• Teploty kolony 60 °C, průtok 0,3 mL/min, injekce 10 pmol vzorku.
• Detektory: TOF a QTof (Xevo G2-XS) pracující v negativním ESI režimu.
• Software: waters_connect INTACT Mass (BayesSpray dekonvoluce) a CONFIRM Sequence pro MS/MS analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

V modelovém vzorku 21-meru bylo identifikováno celkem 11 nečistot s relativními abundancemi od 0,2 % do 6,3 % a hmotnostní přesností lepší než 10 ppm.

INTACT Mass umožnil plně automatizovanou dekonvoluci spekter napříč chromatogramem a přiřazení nečistot v souladu s UV kvantifikací.

CONFIRM Sequence dosáhl sekvenačního pokrytí 75–100 % pro hlavní produkt i vybrané nečistoty, včetně 100% pokrytí u 21-meru a 95 % u nejmenší 11-mer nečistoty.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizované workflow zkracuje čas analýzy a minimalizuje manuální zásahy, čímž zvyšuje reprodukovatelnost a soulad s regulačními požadavky.

Metoda umožňuje detekci a potvrzení nečistot při velmi nízkých úrovních, což je klíčové pro vývoj a kontrolu kvality oligonukleotidových léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metodiky na různé modifikace oligonukleotidů, včetně konjugovaných a strukturálně složitějších molekul.

Integrace pokročilých algoritmů pro dekonvoluci a AI-poháněnou interpretaci MS dat může dále zvýšit rychlost a přesnost analýzy.

Vývoj rychlejších chromatografických metod a adaptace na high-throughput platformy podpoří screening větších knihoven oligonukleotidů.

Závěr

Prezentované řešení spojuje LC-MS analytiku s pokročilým softwarem, umožňuje rychlé a spolehlivé potvrzení hmotnosti, čistoty a sekvence syntetických oligonukleotidů i stopových nečistot. Workflow je plně compliance-ready a přináší významné zlepšení ve vývoji a kontrole kvality oligonukleotidových terapeutik.

Reference

1. Sharma VK, Watts JK. Oligonucleotide therapeutics: chemistry, delivery and clinical progress. Future Med Chem. 2015;7(16):2221–2242.
2. Waters application note P/N 720006820EN. An Automated Compliance-Ready LC-MS Workflow for Intact Mass Confirmation and Purity Analysis of Oligonucleotides. 2020.
3. Waters application note P/N 720007301EN. Analysis of Oligonucleotide Impurities on the BioAccord System with ACQUITY Premier. 2021.
4. Waters application note P/N 720007546EN. LC-MS Analysis of siRNA, Single Guide RNA and Impurities using the BioAccord System with New Automated INTACT Mass. 2022.
5. Waters application note P/N 720007677EN. CONFIRM Sequence: a waters_connect Application for Sequencing of Synthetic Oligonucleotide and Their Impurities. 2022.