A Semi-Automated Lipid Extraction Protocol Using the Agilent Bravo Automated Liquid Handling Platform

Význam tématu

Lipidomika umožňuje podrobnou identifikaci a kvantifikaci lipidů v biologických vzorcích. Kvalitní a reprodukovatelná příprava vzorků je nezbytná pro přesné výsledky v analýze lipidů. Manuální extrakční protokoly jsou často zdlouhavé, náchylné k chybám a vyžadují manipulaci s toxickými organickými rozpouštědly. Automatizace tohoto procesu proto přináší výrazné zlepšení v efektivitě, bezpečnosti a jednotnosti výsledků.

Cíle a přehled studie

Tento aplikační zápis popisuje polozautomatizovaný protokol extrakce membránových fosfolipidů a sfingolipidů z lidské plazmy s využitím platformy Agilent Bravo. Hlavním cílem je zkrátit čas přípravy vzorků, minimalizovat ruční zásahy a dosáhnout vysoké reprodukovatelnosti extrakce, která bude kompatibilní s následnou analýzou pomocí UHPLC/MS/MS.

Použitá metodika

• Přenos 10µl plazmy z 1,5ml Eppendorfových zkumavek do 96-jamkové destičky udržované při 4 °C.
• Přidání extrakčního roztoku butanol:methanol (1:1) s vnitřními standardy.
• Uzavření jamky PCR víčky a homogeneizace na VarioMag Teleshake shakeru.
• Sonikace v ultrazvukové lázni po dobu 60 min, následná centrifugace při 4 000 rpm po dobu 20 min pro odstranění bílkovin.
• Odběr 70 µl čistého supernatantu do nové destičky pro přímou injekci do UHPLC/MS/MS.

Použitá instrumentace

• Agilent Bravo Automated Liquid Handling Platform se 96kanálovou LT hlavou a CPAC Ultra-flat chlazením.
• VarioMag Teleshake Plate Shaker, Branson Ultrasonic Bath, Sorvall RT Legend centrifuga.
• Agilent 1290 Infinity Series UHPLC a 6460 Triple Quadrupole MS.
• Kolona ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD 2.1×50 mm, 1.8 µm a mobilní fáze s amonnými solemi.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání 12 paralelních extrakcí manuální a polozautomatizované metodou ukázalo velmi vysokou korelaci koncentrací endogenních lipidů (R² = 0,9964). Polozautomatizovaný protokol dosáhl nižších hodnot relativní standardní odchylky (%RSD) u všech testovaných lipidových standardů (4–7 % vs. 5–12 % manuálně). Doba přípravy 96 vzorků klesla ze zhruba 8 hodin na pouhé 2 hodiny.

Přínosy a praktické využití metody

• Významné zrychlení workflow a zvýšení kapacity vyšetření velkých souborů vzorků.
• Vysoká reprodukovatelnost a snížení rizika lidské chyby.
• Minimalizace expozice laboratoře nebezpečným rozpouštědlům.
• Možnost zavedení do rutinních laboratoří pro epidemiologické a klinické studie lipidomiky.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Plná automatizace přípravy vzorků s integrací do LIMS systémů.
• Adaptace protokolu pro další biologické matrice (tkáně, buňky, bioodpady).
• Propojování s vysoce výkonnými hmotnostními analyzátory pro rozšíření lipidového profilu.
• Miniaturizace a úspora rozpouštědel pro ekologičtější provoz.

Závěr

Poloautomated extrakční protokol na platformě Agilent Bravo nabízí rychlou, bezpečnou a vysoce reprodukovatelnou přípravu vzorků pro lipidomiku. Výrazné zkrácení doby přípravy a snížení variability zjednodušuje analýzu velkých sbírek vzorků a snižuje náklady na laboratorní provoz.

Reference

• Wenk MR. Lipidomics: New Tools and Applications. Cell. 2010;143(6):888–895.
• Bligh EG, Dyer WJ. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. Can J Biochem Physiol. 1959;37(8):911–917.
• Albert KJ. Optimizing Accuracy Performance on an Agilent Bravo platform using the Artel MVS. Artel Application Note. 2013;12A6480A.