A fast and simple workflow for surrogate peptide bioanalysis: NISTmAb case study

Význam tématu

Analýza monoklonálních protilátek (mAbs) je zásadní pro vývoj a registraci bioterapeutik. Vysoce citlivé a selektivní metody kvantifikace v malém množství biologické matrice zrychlují rozhodování v preklinické i klinické fázi, snižují náklady a zvyšují úspěšnost vývoje léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ověřit rychlý a jednoduchý pracovní postup pro kvantitativní bioanalýzu humanizovaných či chimérických mAbs z netypické matrice (např. potkaní plazmy) pomocí imunokaptury, tryptického štěpení a LC-MS/MS detekce na modelovém přípravku NISTmAb (RM 8671).

Použitá metodika a instrumentace

Workflow kombinuje:

• Imunokapturu na magnetických peletách SMART Digest IA Protein G s protilátkou proti lidskému Fc.
• Jednokrokové štěpení trypsinem aktivovaným vysokou teplotou přímo na peletách.
• UHPLC separaci na Acclaim 120 C18 kolóně (50 × 2,1 mm, 2,2 µm) s jednoduchým gradientem vody a acetonitrilu (0,1 % HCOOH).
• Detekci na TSQ Quantiva triple quadrupolárním MS v pozitivním módu se sledováním dvou tryptických peptidů z Fc oblasti (TTPPVLDSDGSFFLYSK, VVSVLTVLHQDWLNGK) a stabilně izotopově značeného interního standardu.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje lineární rozsah 10–10 000 ng/mL při LLOQ 10 ng/mL ze vzorku 50 µL plazmy. Kalibrační křivka vykazovala koeficient determinace R² > 0,998. Střední přesnost QC vzorků (50, 500, 5000 ng/mL) se pohybovala v rozmezí –6 % až +9 %, zatímco relativní odchylka (RSD) nepřekročila 9 %. Obnova z vody činila 97 % (RSD < 1,5 %), z plazmy průměrně 73 % (RSD ≈ 8,6 %). Matricová deprese signálu v plazmě zůstala pod 11 %. Optimální doba imunokaptury byla stanovena na 120 min, digesce trvala 60 min.

Přínosy a praktické využití metody

Stručný a přímý postup umožňuje zpracovat 96 vzorků za méně než 4 hodiny a redukuje počet pipetovacích kroků. Unifikované podmínky imunokaptury a digesce lze snadno aplikovat na různé humanizované nebo chimérické mAbs v předklinických studiích, což zkracuje čas metrologického vývoje a minimalizuje riziko chyb.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření multiparalelních workflow s automatizací imunokaptury a digesce, integrace s mikrofluidními platformami a využití vysokorozlišovací MS k simultánní analýze více mAb formací. Další vývoj se zaměří na aplikaci v lidské matrici s vyšší specifičností výběru surrogate peptidů z variabilní oblasti.

Závěr

Popisovaný pracovní postup kombinuje rychlou imunokapturu a termálně asistovanou digesci v jedné jámě, dosahuje vynikajících analytických parametrů a lze jej přenést na širokou škálu monoklonálních protilátek v biologických maticích s minimální optimalizací.

Reference

1. Kaitin KI. Obstacles and opportunities in new drug development. Clin. Pharmacol. Ther. 2008;83:210-212.
2. SMART Digest ImmunoAffinity (IA) Kit User Manual, Version 1, Revision A. Thermo Fisher Scientific.
3. Thermo Fisher Scientific Application Note 21504: Fast Digestion Method Optimization.
4. Using Innovative Trypsin Technology, 2016, Thermo Fisher Scientific.
5. Thermo Scientific Acclaim 120 C18 columns. Thermo Fisher Scientific.