A fast and simple immuno-mass spectrometry method for preclinical bioanalysis for IgG1 mAb

Význam tématu

Analýza terapeutických monoklonálních protilátek (mAb) v preklinické fázi je klíčová pro sledování farmakokinetiky, farmakodynamiky a toxikokinetiky bioléčiv. Vysoká citlivost, selektivita a rychlost stanovení umožňují získat spolehlivá data během vývoje a urychlit rozhodování o dalším postupu ve farmacii.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout univerzální, rychlou a jednoduchou immuno-mass spektrometrickou metodu pro kvantifikaci IgG1 mAb ve všem klinicky používaném preklinickém séru zvířat bez potřeby specifických protilátek pro každý analyzovaný lék. Metoda kombinovala imunokapturu na magnetických částicích se simultánní proteolýzou a cílenou kvantifikací peptidů pomocí vysoce rozlišovací hmotové spektrometrie.

Použitá instrumentace

Reagencie a spotřební materiál

• SMART Digest IA Kit (av streptavidin magnetické částice)
• CaptureSelect Human IgG-Fc Biotin Conjugate
• SILuMAB K1 izotopově značený mAb standard

Zařízení

• DynaMag-2 magnet
• KingFisher Duo Prime nebo Flex pro automatizaci
• Thermal Mixer, HulaMixer
• Vanquish Binary Flex UHPLC
• Orbitrap ID-X nebo Q Exactive Plus hmotový spektrometr

Použitá metodika

Simplifikovaný čtyřkrokový protokol:

• Imobilizace biotinylovaného Fab ligandu na streptavidinové magnetické částice (RT, 40 min)
• Imunokaptura IgG1 z 50 µL séra (RT, 90 min při jemném míchání)
• Omytí pro odstranění nespecifických proteinů bez použití detergentů
• Současná denaturace a trávicí inkubace s trypsinem připevněným na částicích (70 °C, 60 min)

Po trávicí fázi se oddělily částice a získaný supernatant byl připraven k analýze LC–MS/MS v módu PRM.

Hlavní výsledky a diskuse

Selektivita a účinnost imunokaptury byla >95 % pro koncentrace IgG1 do 40 µg/mL v různých sérových matricích (myš, krysa, pes, makak). Testy specificity prokázaly odstranění maticových interferencí až na úroveň pod 10 % signálu LLOQ. Byly identifikovány čtyři konzervované peptidy z konstantních domén (CL, CH1, CH3 a oblast mezi CH2/CH3), vhodné jako signature peptidy. Digestion recovery on-bead dosahovalo >90 % pro domény CL a CH1/CH3, zatímco CH2 dome­na vykazovala omezenou přístupnost kvůli vazbě ligandu.
Limit kvantifikace LLOQ dosahoval 20–50 ng/mL při objemu vzorku 50 µL. Linearita byla ověřena v rozsahu 39–10 000 ng/mL s koeficientem determi­nace r2 >0,99. Mezi­denní a vnitrodenní přesnost a precizita CV <10 %, návratnost 90–110 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá příprava vzorku za 4–5 hodin s možností plné automatizace pro vysokou propustnost.
• Univerzální aplikace na všechny IgG1 mAb v preklinických matricích bez nutnosti vývoje specifických protilátek.
• Simultánní měření několika signature peptidů umožňuje i sledování strukturální integrity mAb.
• Vysoká citlivost a selektivita díky kombinaci imunokaptury a vysoce rozlišovací hmotové spektrometrie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zvyšování citlivosti díky větším objemům vzorku a optimalizaci SB-LC fází. Metoda lze rozšířit na další izotypy protilátek či na ADC konjugáty. Integrace s vícekanálovými platformami a robotickými stanovišti umožní další zvýšení propustnosti. Kombinace s multiplexní kvantifikací a monitorováním posttranslačních modifikací nabízí rozšíření aplikačního spektra.

Závěr

Vyvinutá immuno-mass spektrometrická metoda na bázi SMART Digest IA a CaptureSelect ligandu představuje univerzální, citlivý a rychlý přístup pro bioanalýzu IgG1 mAb v preklinických studiích. Spojuje jednoduchou přípravu vzorku, vysokou propustnost a spolehlivou kvantifikaci s možností sledovat i strukturní integritu protilátek.

Reference

1. Jenkins et al., AAPS J., 2015, 17(1), 1–16
2. Qu et al., Mass Spectrom. Rev., 2017, 36(6), 734–754
3. Heudi et al., Anal. Chem., 2008, 80(11), 4200–4207
4. Li et al., Bioanalysis, 2011, 3(21), 2459–2480
5. Ouyang et al., Bioanalysis, 2012, 4(1), 17–28