Reproducible IA-LC-MS/MS quantitation of human IgG from plasma with SMART Digest Fractionation Kits

Význam tématu

Rychlá a reprodukovatelná kvantifikace lidských protilátek IgG v komplexních biologických matricích je klíčová pro výzkum, vývoj bioterapeutik a monitorování pacientů. Spojení imunovazebné extrakce s LC-MS/MS analýzou zvyšuje selektivitu a citlivost oproti tradičním ELISA metodám, které mohou trpět křížovou reaktivitou a omezenou specifičností.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit použití SMART Digest Bulk Fractionation kitů s Protein G pro rychlou imunoafinitní extrakci a tryptickou digesci lidského IgG ve vzorcích myší plazmy. Hlavním přínosem je zkrácení a zjednodušení přípravy vzorku, odstranění kroku biotinylace protiprotilátky a zvýšení čistoty extraktu pro analýzu pomocí SRM LC-MS/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky myší plazmy s navázaným lidským IgG byly 40× naředěny do pH 7,4 TBS a inkubovány s Protein G magnetickými kuličkami SMART Digest. Po dvou mytích TBS následovala digesce přídavkem rozpustného trypsinu při 70 °C po dobu 90 minut. Hydrolyzáty se kyselily TFA, injektovaly 50 µL na rychloraozlišovací LC systém UltiMate 3000 a analyzovaly na iontovém pasti Velos Pro v režimu SRM.

Použitá instrumentace

• SMART Digest Bulk Fractionation kit, Protein G, magnetický, se solvabilním trypsinem
• UltiMate 3000 Rapid Separation LC System (SRD-3600, DGP-3600RS, WPS-3000TRS, TCC-3000RS)
• Iontový trap Velos Pro s HESI zdrojem
• Accucore C18 kolona 2,1×50 mm, 2,6 µm
• Software Xcalibur pro řízení a zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vynikající linearitu kalibračních křivek pro MR čepy m/z 603,4 a 937,7 v rozsahu 0,1–100 µg/mL (R² > 0,999). Přesnost a opakovatelnost (CV) kvalifikačních vzorků byla nižší než 6,5 % v celém rozsahu koncentrací, což potvrzuje vysokou reprodukovatelnost vychytání a digesce IgG.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow výrazně zkracuje čas přípravy vzorku (ze 24 hodin na ~1 hodinu), eliminuje nutnost opakované validace protiprotilátky a poskytuje čisté digesty vhodné pro citlivou LC-MS/MS analýzu. Metoda je univerzální pro různé druhy imunoglobulinů a biologické matice.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace multicentrových validací, automatizace na robotických platformách a rozšíření na multiplexní kvantifikaci různých tříd protilátek či dalších bílkovinných markerů. Díky modulární povaze SMART Digest kitů lze workflow adaptovat pro nové bioterapeutické molekuly a klinické aplikace.

Závěr

Použití SMART Digest Bulk Fractionation kitů s Protein G pro imunoafinitní extrakci a digesci lidského IgG v myší plazmě nabízí rychlou, reprodukovatelnou a vysoce citlivou metodu pro LC-MS/MS analýzu. Metoda předčila tradiční postupy v oblasti jednoduchosti, čistoty vzorku a robustnosti.

Reference

1. Global biologics market overview, Transparency Market Research, 2018.
2. Ramagiri S. a Moore I., Bioanalysis 2016, 8(6):483–486.
3. Ewles M. et al., Bioanalysis 2016, 8(24):2565–2579.
4. Thermo Fisher Scientific application note AN21698, SMART Digest SOLAu, 2020.
5. Comparison of Antibody IgG Binding Proteins, Thermo Fisher Scientific.