Rapid quantitation of therapeutic antibodies in animal plasma

Význam tématu

Rychlá a citlivá kvantifikace terapeutických monoklonálních protilátek (mAb) v biologických vzorcích je klíčová pro preklinický vývoj, farmakokinetiku a kontrolu kvality biotherapeutik. Tradiční workflowy IA-LC/MS/MS zahrnují vícestupňové obohacení, denaturaci, redukci, alkylaci a digesci, což vede k dlouhým časům přípravy (~24 h) a vysoké variabilitě.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat, že SMART Digest Immunoaffinity (IA) soupravy propojují imunokapturu a enzymatickou digesci v jedné jámě 96-well destičky, zkracují přípravu vzorku na 3–4 h a dosahují citlivosti <10 ng/mL při robustní linearitě a reprodukovatelnosti.

Použitá metodika a instrumentace

• Imunoafinity soupravy SMART Digest IA Streptavidin, Protein A a Protein G (magnetické i nemagnetické provedení).
• Krok přípravy: biotinylace protilátky, vazba na kuličky, inkubace se sérem, praní, jednorázové zahřívání na 70 °C a on-bead trávicí trypsinací.
• LC/MS/MS: UHPLC UltiMate 3000 Rapid Separation s Accucore C18 kolonkou 2,1×50 mm, 2,6 μm; mobilní fáze A 0,1 % FA/2 % ACN, B 0,1 % FA/90 % ACN, gradient 90→10 % A za 5 min.
• Detekce: Thermo Scientific Velos Pro iontový pastiový MS ve vybraných přechodech (SRM) pro peptidy VVSVLTVLHQDWLNGK (Q1 603,4→805,4) a TTPPVLDSDGSFFLYSK (Q1 937,7→836,5).

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace: dobu imunokaptury i digesce bylo nutné nastavit na 60 min pro kompletní vazbu a rozklad IgG. Souprava IA Streptavidin poskytla lineární kalibraci 5–1 580 ng/mL s R² > 0,995; Protein A/G 6–6 000 ng/mL s R² > 0,99. Mezi-a vnitrodana variabilita (CV) byla v rozmezí 2,3–6 %. Celková doba přípravy vzorku k analýze se zkrátila o více než 80 % oproti klasickému workflow.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení času na 3–4 h a zjednodušení workflowu na pět kroků.
• On-bead obohacení i digesce v jedné jámě minimalizuje ztráty a variabilitu.
• Citlivost <10 ng/mL vhodná pro preklinické studie.
• Metoda je univerzální pro různé mAb díky monitorování Fc-peptidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s robotickou přípravou vzorků (např. KingFisher).
• Rozšíření na multiplexní analýzy a jiné typy biotherapeutik.
• Využití magnetického formátu pro vysokou propustnost laboratorních pracovišť.
• Kombinace s pokročilými MS přístroji pro další zvýšení citlivosti.

Závěr

SMART Digest IA soupravy přinášejí rychlý, robustní a citlivý jednoduchostní postup pro kvantifikaci monoklonálních protilátek v živočišném séru. Jednonádobový protokol zkracuje čas přípravy vzorků o více než 80 %, při zachování širokého dynamického rozsahu, reprodukovatelnosti a nízkého LLOQ.

Reference

• Ewles M. et al. LC–MS/MS strategies for therapeutic antibodies and impact of antidrug-antibodies. Bioanalysis, 2016, 8(24):2565–2579.
• Bardsley J. et al. Improvement in Speed and Reproducibility of Protein Digestion Utilizing Novel Sample Preparation Technology. Thermo Fisher Scientific Application Note AN21198.
• SMART Digest IA User Manual. Thermo Fisher Scientific, 2017, Man-21549-EN.
• Comparison of Antibody IgG Binding Proteins. Thermo Fisher Scientific, online resource.
• Berna M. & Ackermann B. Increased Throughput for Low-Abundance Protein Biomarker Verification by LC/MS. Anal. Chem. 2009, 81:3950–3956.