Simultaneous reversed-phase and anion-exchange method scouting with a dual system for mRNA impurity determination

Význam tématu

Posttranskripční analýza mRNA je klíčová pro kontrolu kvality léčiv a biotechnologický výzkum. Optimalizované chromatografické metody umožňují rychlou a spolehlivou detekci nečistot, jako jsou zbytky enzymů, fragmenty DNA či dvojvláknové RNA, což je zásadní pro bezpečnost a účinnost mRNA založených terapií.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo simultánně optimalizovat separační podmínky pro iontově-párovou reverzní fázi (IP-RP) a aniontovou výměnu (IEX) na jednom chromatografickém systému pro detekci posttranskripčních nečistot v mRNA. Studie demonstruje efektivní scoutingový přístup k identifikaci nejvhodnějších eluentních a teplotních parametrů.

Použitá metodika

Analýzy byly provedeny na systému Thermo Scientific Vanquish Duo pro Dual LC s Method Scouting Kit. Pro IP-RP byl použit DNAPac RP sloupec (2,1 × 100 mm, 4 µm) a pro IEX DNAPac PA200 RS sloupec (4,6 × 150 mm, 4 µm). Scouting zahrnoval devět podmínek pro IP-RP a osm pro IEX s různými iontovými páry (HAA, TEAA, DIPEA) a eluentními systémy (TRIS, NaOH, perchlorát) při teplotách 30 – 90 °C.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Duo pro Dual LC
• Method Scouting Kit pro automatizaci scoutingových běhů
• DNAPac RP 2,1 × 100 mm, 4 µm (P/N 088923)
• DNAPac PA200 RS 4,6 × 150 mm, 4 µm (P/N 082509)
• UV detektor se snímáním až do 310 nm
• Autosampler chlazený na 4 °C

Hlavní výsledky a diskuse

Studie identifikovala několik vhodných metod, z nichž pro IP-RP vedla 25 mM HAA při 50 °C a pro IEX 40 mM TRIS s 0,8 M NaClO₄ a 20 % MeCN při 80 °C. Obě módy poskytly podobné odhady čistoty mRNA (~92 %), přičemž IEX nabídla detailnější profilaci drobných fragmentů nečistot.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby vývoje metod díky simultánnímu scoutingovému přístupu
• Přímé srovnání výkonu IP-RP a IEX na jednom systému
• Kvantitativní a kvalitativní profilace nečistot v mRNA
• Vysoká flexibilita změny eluentních složek a teplotních podmínek

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace více chromatografických režimů s hmotnostní spektrometrií pro detailní identifikaci nečistot. Rozšířená automatizace scoutingových protokolů a validace metod v klinických laboratořích významně zrychlí uvádění nových mRNA terapií do praxe.

Závěr

Simultánní optimalizace IP-RP a IEX na jednom LC systému poskytla efektivní a robustní metody pro analýzu posttranskripčních nečistot v mRNA. Vybrané podmínky zajišťují spolehlivou separaci, kvantifikaci a podrobnou profilaci nečistot, což je nezbytné pro kontrolu kvality mRNA produktů.