Simultaneous reversed-phase and anion-exchange method scouting with a dual system for mRNA impurity determination

Význam tématu

Analýza čistoty mRNA je klíčová pro vývoj mRNA vakcín, terapeutických aplikací a biotechnologický výzkum. Přítomnost nečistot jako fragmenty DNA, dsRNA či zbytky enzymů může ovlivnit bezpečnost, účinnost a stabilitu výsledného produktu. Rychlé a spolehlivé metodiky HPLC pro profilování a kvantifikaci těchto nečistot tak pomáhají zkrátit dobu vývoje a zajistit kvalitu v souladu s požadavky farmaceutické regulace.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo najít optimální chromatografické podmínky pro detekci post-transkripčních nečistot v mRNA za využití současného scoutingového přístupu. Autoři testovali současně reverzní fázi s ion-párováním (IP-RP) a aniontovou výměnnou chromatografii (IEX) na jednom zařízení. Studii charakterizuje široké spektrum mobilních fází, pH a teplot pro oba typy separace.

Použitá metodika

Metoda scouting zahrnovala:

• IP-RP: srovnání tří ion-párovacích činidel (TEAA, HAA, DIPEA) při různých pH a teplotách (50–90 °C), gradient s vodou/MeCN a organickým oplachem.
• IEX: testování pufrů Tris s NaCl nebo NaClO4 při 30–80 °C, gradient od nízké síly eluantu k vysoké koncentraci solí a organické fázi.
• Všechny podmínky byly automaticky měněny pomocí solvent selection ventilu a proměnných v Chromeleon 7.3 CDS.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Vanquish Duo for Dual LC s dvojicí pump, zesplitovaným vzorkovačem a dvěma komorami sloužícími pro IEX a IP-RP kolony.
• Chromeleon 7.3 Chromatography Data System pro řízení scoutingových proměnných a vyhodnocení dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Pro IP-RP byla optimální iontová fáze 25 mM HAA při pH 8,5 při 50 °C, kdy došlo k dostatečnému rozlišení nečistot a tvaru špičky mRNA. Vyšší pH vedlo k špatnému tvaru špičky nebo sníženému signálu. U IEX se nejlepší výsledky dosáhly v Tris/BISoleru NaClO4 (0,8 M) s 20 % MeCN při 80 °C, kdy se mRNA správně eluovala a nečistoty byly detekovány v časných retenčních časech. HODNOCENÍ čistoty ukázalo srovnatelnou relativní plochu hlavní špičky (~91 %) u obou metod, přičemž IEX citlivěji odhalila některé nízkoúrovňové složky.

Přínosy a praktické využití metody

• Současný scouting dvou separačních chemistrů na jednom přístroji výrazně urychluje vývoj metod.
• Vyvinuté postupy umožňují rychlou kontrolu účinnosti mRNA purifikace a kvantifikaci zbytkových nečistot.
• Vysoká biokompatibilita systému dovoluje použití korozivních pufrů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšího zefektivnění lze dosáhnout integrací hmotnostní spektrometrie pro přesnou identifikaci neznámých složek. Vývoj rychlých mikrosekvenčních technik spojitých s HPLC by mohl doplnit profilování sekvenčně specifických impurit. Rozšíření scoutingových postupů na další nukleové kyseliny (siRNA, gRNA) a jejich modifikace pak umožní širší využití v genové terapii a vakcinačním výzkumu.

Závěr

Implementace Vanquish Duo UHPLC se scoutingovým kit výrazně zkrátila dobu vývoje optimalizovaných metod IP-RP a IEX pro analýzu nečistot mRNA. Vybrané podmínky nabízejí robustní a spolehlivé nástroje pro QA/QC laboratoře v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu.

Reference

1. Kanavarioti A. HPLC methods for purity evaluation of single-stranded RNAs. Sci Rep. 2019;9:1019.
2. Thermo Scientific DNAPac RP Columns Product Manual. 2021.
3. Thermo Scientific Application Note TN-185: UHPLC Method Scouting. 2020.
4. Thermo Scientific Technical Note TN-161: Automated Method Scouting System. 2020.