Simultaneous reversed-phase and anion-exchange method scouting with a dual system for mRNA impurity determination

Význam tématu

Využití mRNA v biotechnologii a farmacii zaznamenalo v posledních letech výrazný vzestup. Kvalita a čistota syntetické mRNA je klíčová pro bezpečnost a účinnost výsledných přípravků. Analytické techniky HPLC s různými separačními režimy umožňují spolehlivě detekovat a kvantifikovat posttranskripční nečistoty, které mohou ovlivnit funkčnost mRNA ve výzkumu i klinické praxi.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo najít a porovnat optimální chromatografické podmínky pro simultánní screening reverzní fáze (IP-RP) a aniontově výměnné (IEX) separace mRNA a jejích nečistot za použití jediného přístrojového uspořádání. Autoři představují postup, který umožňuje zkrátit čas potřebný pro vývoj metod a usnadnit rozhodnutí o nejvhodnějších mobile phase pro jednotlivé režimy.

Použitá metodika a instrumentace

Autoři analyzovali jak nepurifikovanou, tak purifikovanou mRNA (~2 500 nukleotidů) pomocí systému Thermo Scientific Vanquish Duo pro Dual LC s Method Scouting Kit. Pro IP-RP bylo použito kolony DNAPac RP (2,1 × 100 mm, 4 μm) a pro IEX kolony DNAPac PA200 RS (4,6 × 150 mm, 4 μm).

• Vanquish Duo Dual LC se Solvent Extension Kit
• Kolona DNAPac RP (reverzní fáze)
• Kolona DNAPac PA200 RS (aniontová výměna)
• Předehřívače na 50/90 °C a 30/50/80 °C
• Autosampler s chlazením na 4 °C a autosampler wash 50/50 acetonitril/voda
• Detektor UV (235/240–310 nm, rychlost sběru 10 Hz)

Hlavní výsledky a diskuse

Pro IP-RP bylo vyzkoušeno devět podmínek s různými iontově párujícími činidly (TEAA, HAA, DIPEA) a teplotami kolony. Pro IEX osm podmínek s TRIS/perchlorátovými pufry a NaOH eluenty. Metoda scoutingového screeningu zabral jediný automatizovaný běh na jednom přístroji, přičemž byly identifikovány následující vhodné podmínky:

• IP-RP: 25 mM HAA, gradient s mycelií acetonitrilu a vodné fáze
• IEX: 40 mM Tris/0,8 M perchlorát/20 % MeCN při 80 °C

Porovnání purifikované a nepurifikované mRNA ukázalo podobné odhady čistoty (~92 % vs. ~91 %) při obou režimech. IEX režim však poskytl detailnější profil nečistot.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda je časově i materiálově efektivní, jelikož umožňuje simultánní scouting dvou odlišných separačních chemistriemi. Laboratoře zabývající se vývojem mRNA vakcín a léčiv mohou rychle určit optimální chromatografické podmínky pro monitorování čistoty a stability mRNA preparátů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace automatizovaných metod scouting do workflow pro vývoj biopharmaceutik. Kombinace s hmotnostní spektrometrií a pokročilou datovou analýzou umožní podrobnější charakterizaci nečistot a modifikací mRNA. V budoucnu může metoda sloužit i pro vysokopropustný screening různých mRNA konstrukcí.

Závěr

Použití Vanquish Duo Dual LC s metodou scouting ukázalo vysokou účinnost při identifikaci optimálních chromatografických podmínek pro IP-RP a IEX separaci mRNA. Vybrané podmínky poskytují spolehlivou detekci nečistot a srovnatelný odhad čistoty s detailnějším profilem ve prospěch IEX.

Reference

• Ispan DA, Lovejoy K, Paul C, Valenta A, De Pra M. Simultaneous reversed-phase and anion-exchange method scouting with a dual system for mRNA impurity determination. Thermo Fisher Scientific Application Note, 2022.