ENHANCED DECLUSTERING AND CHARGE-STRIPPING ENABLES MASS DETERMINATION OF AAVS IN TOF MS

Význam tématu

AAV kapsidy jsou perspektivní vektory pro genovou terapii díky své schopnosti efektivně doručovat genetický materiál. Přesná charakterizace jejich hmotnosti a složení je nutná pro výzkum, vývoj a kontrolu kvality těchto bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo zlepšit determinaci hmotnosti virusových částic AAV prostřednictvím kombinace vylepšené deklustrace a stripování náboje, čímž se dosáhne rozlišení jednotlivých nábojových stavů a umožní se přesná dekonvoluce hmotnostních profilů.

Použitá metodika

• Příprava vzorků: dialýza a výměna pufru do 150 mM amonného acetátu.
• Infuze vzorků pomocí nanoESI (PicoTip, New Objective).
• Enhanced declustering v modifikované StepWave ion guide s paralelními deskami a střídavým napětím (~50 kHz, 300 Vp-p) pro odstranění aduktů.
• Charge stripping pomocí elektromagnetostatiké ECD cely (ExD WK-150, eMSion) pro redukci průměrného náboje a znásobení m/z rozsahu.
• Dekonvoluce dat modifikovaným MaxEnt1 algoritmem.

Použitá instrumentace

• SELECT SERIES Cyclic IMS – ToF (Waters Corporation)
• Modifikovaný StepWave ion guide (Waters)
• Eletromagnetostatiká ECD cell ExD WK-150 (eMSion)
• nESI emitery PicoTip (New Objective)
• Dialyzační filtry Amicon 10K (Merck) a Bio-Spin (Bio-Rad)

Hlavní výsledky a diskuse

• Standardní analýza bez úprav vykazovala široké a featureless spektrum AAV ve středních m/z ~23 000 (empty) a ~30 000 (full).
• Enhanced declustering odhalilo jemné strukturální rysy s m/z rozestupy ~50, ale jejich simultánní dekonvoluce byla náročná.
• Charge stripping (ECnoD) posunulo spektrum do vyšších m/z (z ~20 000 na ~90 000), zpřehlednilo nábojové stavy a umožnilo dekonvoluci hmotnostního profilu (nejhojnější hmotnost ~3,580 MDa).
• Modelování multinominální distribuce pro VP1 : VP2 : VP3 [0.01 : 0.03 : 0.96] ukázalo nejpravděpodobnější komplexy s poměry [0 : 1 : 59] a [0 : 2 : 58].
• Asymetrie dekonvoluovaného profilu může odrážet adukty, biologickou variabilitu nebo artefakty procesu přípravy.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zlepšení rozlišení a přesnosti hmotnostní analýzy AAV.
• Detailní stanovení VP substichiometrie a aduktů.
• Využití při vývoji a kontrole kvality genových terapií a biotechnologických výrobků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Analýza fragmentů vzniklých v ECD a ověření přesnosti hmotnostních měření.
• Porovnání s daty získanými CDMS a na úrovni rozštěpených proteinů.
• Vylepšení dekonvolučních algoritmů pro komplexní distribuční vzory.
• Aplikace postupů na jiné virové vektory a makromolekuly.

Závěr

Kombinace modifikované StepWave pro enhanced declustering a ECD stripování náboje poskytuje významný pokrok v hmotnostní analýze AAV, umožňuje detailní rozlišení nábojových stavů, přesnou dekonvoluci hmotnostních profilů a kvalitativní i kvantitativní charakterizaci komplexních virových částic.

Reference

1. Johnson et al. Journal of Virology, 1971, 8, 860–863
2. Sokratous et al. 68th ASMS “Reboot” Proceedings, 2020, 303789
3. Beckmann et al. 69th ASMS Conference Proceedings, 2021, 303977
4. Pierson et al. Analytical Chemistry, 2016, 88, 13, 6718-6725
5. Todd et al. Analytical Chemistry, 2020, 92, 11357−11364
6. Wörner et al. Nature Communications, 2021, 12, 1642
7. Zhang et al. Human Gene Therapy, 2021, 32, 23-24