STABILITY CHARACTERIZATION OF MULTIPLE SEROTYPES OF ADENO-ASSOCIATED VIRUS USING CHARGE DETECTION MASS SPECTROMETRY

Význam tématu

Gene terapie vyuzivaji AAV jako vektory doruceni geneticke informace do bunek. Stabilita AAV capsidu zavisi na serotypu a teplotnich podminkach, cimz ovlivnuje ucinnost lecby. Systematicke zkoumani jejich odolnosti je klicove pro hospodarne skladovani a prepravu.

Cile a prehled studie

Cilem studie bylo charakterizovat stabilitu dvou serotypu AAV 5 a AAV 8 pri ruznych teplotach pomoci Charge Detection Mass Spectrometry. Klucove bylo sledovat pomer plnych, casticne naplnanych a prazdnych capsidu po pul hodine inkubace pri 4°C, 22°C, 35°C a 50°C.

Pouzita metodika a instrumentace

• Vzorky plnych a prazdnych AAV capsidu z dodavky Virovek s koncentraci 2,0 x 10^13 vg/mL
• Vymena pufru na 200 mM amonium acetat s 0,01% Pluronic F68
• Rozdeleni vzorku do ctyr kategorii a inkubace pri vyse uvedenych teplotach po dobu 30 minut
• Analyza na prototype stolniho CDMS modifikovaneho Megadalton Solutions spojeneho s Nanomate Triversa se 5 µm tryskou
• Kalibrace nabojove domeny pomoci glutamate dehydrogenase
• Sber dat dokud nebylo detekovano priblizne 3000 iontu v oblasti 2-6 MDa
• Zpracovani signalu a vizualizace pomoci interniho softwaru

Hlavni vysledky a diskuse

• Oba serotypy vykazaly tri hlavni populace capsidu s hmotnostmi priblizne 5,4 MDa, 4,7 MDa a 3,8 MDa odpovidajici plnym, casticne naplnanym a prazdnym capsidum
• S rostouci teplotou od 22°C do 50°C klesla relativni zastoupeni plnych capsidu o 10-14%, casticne naplnenych o 10% a prazdnych se zvysila o 18-24%
• Pomery plneho k prazdnemu, plneho k casticne naplnenemu a prazdneho k casticne naplnenemu ukazuji linearni trend pro oba serotypy
• Data podporuji postupnou ztratu nukleove kyseliny pri vyssich teplotach bez okamziteho zhrouceni strukturni integrity

Prinosy a prakticke vyuziti metody

• Rychla a presna kvantifikace plnych, casticne naplnenych a prazdnych capsidu
• Podpora kvality a kontroly stability AAV v procesu vyroby a skladovani
• Optimalizace podminek prepravy a dlouhodobeho uchovavani vzorku

Budouci trendy a moznosti vyuziti

• Rozvoj CDMS s vyssim vykonem a schopnosti vysokopruchodove analyzy
• Integrace s chromatografickou front end modulaci pro oddeleni serotypu a variaci
• Realne casove sledovani stability a integrace s umelou inteligenci pro pokrocilou analyzu dat
• Extenze studia na dalsi serotypy a modifikovane vektorove platformy

Zaver

Prototype CDMS dokaze efektivne charakterizovat stabilitu AAV serotypu pri ruznych teplotach. Pozorovana zmena priblizne 10% poklesu plneho capsidu mezi 22°C a 50°C muze ovlivnit integritu a ucinnost gene terapie.

Reference

1. Bee JS, Zhang YZ, Phillippi MK, Finkner S, Mezghebe T, Webber K, Cheung WD, Marshall T. Impact of Time Out of Intended Storage and Freeze-thaw Rates on the Stability of Adeno-associated Virus 8 and 9. J Pharm Sci. 2022;111:1346-1353.
2. Pierson EE, Keifer DZ, Asokan A, Jarrold MF. Resolving Adeno-Associated Viral Particle Diversity with Charge Detection Mass Spectrometry. Anal Chem. 2016;88:6718-6725.
3. Jarrold MF. Applications of Charge Detection Mass Spectrometry in Molecular Biology and Biotechnology. Chem Rev. 2022;122:7415-7441.
4. Kostelic MM, Ryan JP, Brown LS, Jackson TW, Hsieh C-C, Zak CK, Sanders HM, Liu Y, Chen VS, Byrne M, Aspinwall CA, Baker ES, Marty MT. Stability and Dissociation of Adeno-Associated Viral Capsids by Variable Temperature-Charge Detection-Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022;94:11723-11727.