Quantitative analysis of genome packaging in adeno-associated viruses using native MS

Význam tématu

Adeno-asociované viry rekombinantního původu představují klíčovou platformu pro doručování genové terapie. Přesné kvantitativní rozlišení plných a prázdných kapsid je nezbytné pro stanovení dávky i minimalizaci nežádoucích imunitních reakcí. Tradiční metody jako ultracentrifugace či chromatografie nabízejí omezenou citlivost a nenabízejí přímé rozlišení jednotlivých typů kapsid na molekulární úrovni.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat schopnost nativní hmotnostní spektrometrie na přístroji Q Exactive UHMR Hybrid Quadrupole-Orbitrap k rychlé a přesné kvantifikaci genomového naložení v AAV kapsidách. Byly porovnány vzorky prázdných a plných kapsid reference AAV8, smíchané v různých poměrech, a vyhodnocena robustnost metody při různém nastavení rozlišení.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky AAV8 byly připraveny buď přímým naředěním v 100 mM roztoku uhličitanu amonného pH 6,8, nebo výměnou pufru pomocí Zeba spin desalting columns Thermo Scientific. Analýza probíhala technikou statické nanoESI pomocí dvojitě potažených nESI kapilár. Hlavní instrumentace:

• Q Exactive UHMR Hybrid Quadrupole-Orbitrap mass spectrometer
• Nanospray Flex ion source
• Zeba spin desalting columns

Optimalizační parametry zahrnovaly kladný iontový režim, rozlišení až 25000 při m/z 200, acetamidaci teploty kapiláry 250 °C a prodloužený akumulační čas až 200 ms.

Hlavní výsledky a diskuse

Prázdné kapsidy vykazovaly zřetelný signálový shluk kolem m/z 24000, plné kapsidy byly registrovány nad m/z 28500. Tento posun o přibližně 800 kDa koresponduje s hmotností vloženého genomu cca 2,5 kb. Směsi prázdných a plných kapsid v poměrech 1:1 a 1:5 potvrdily rozlišitelnost i při různém zastoupení. Pomocí integrace ploch signálových shluků v aplikaci ImageJ byla vypočtena frakční abundance plných kapsid (58,5 % pro 1:1 a 76,6 % pro 1:5). Navíc se ukázala vysoká stabilita výsledků při změně rozlišení od 3500 do 25000, kdy byla detekována konzistentní hodnota okolo 61 % plných kapsid ve směsi 1:1.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlou analýzu bez komplikovaných přípravných kroků, minimalizuje ztráty vzorku a poskytuje přímé kvantitativní rozlišení plných a prázdných kapsid. Je ideální pro kontrolu kvality během downstream procesů, stanovení dávkování a sledování stability výrobku v gene therapy výrobě.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem může být integrace charge detection MS pro detekci částečně naplněných kapsid, použití redukce náboje k jemnému rozlišení a automatizace kvantifikace v průběhu výrobního cyklu. Rozšíření aplikace na jiné serotypy AAV a rozvoj on-line monitoringu procesů bude přispívat k vyšší efektivitě a reprodukovatelnosti genové terapie.

Závěr

Studie prokázala, že nativní MS na platformě Q Exactive UHMR je efektivní a robustní nástroj pro kvantifikaci genomového balení v AAV kapsidách. Metoda poskytuje přesná, rychlá a reprodukovatelná data s minimálními nároky na přípravu vzorku a nabízí široké uplatnění v oblasti bioprocesního vývoje genové terapie.

Reference

1. Zhao Z et al. Viral vector-based gene therapies in the clinic. Bioeng Transl Med. 2022;7:e10258.
2. Wang D et al. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18:358–378.
3. Werle AK et al. Comparison of analytical techniques to quantitate capsid content of AAV. Mol Ther Methods Clin Dev. 2021;23:254–262.
4. Strasser L et al. Native MS assay for rapid assessment of empty:full capsid ratio. Anal Chem. 2021;93:12817–12821.
5. Worner TP et al. AAV capsid assembly is divergent and stochastic. Nat Commun. 2021;12:1642.
6. Worner TP et al. Orbitrap-based charge-detection MS for AAV. Mol Ther Methods Clin Dev. 2022;24:40–47.
7. Barnes LF et al. Quantitative analysis of genome packaging by CDMS. Mol Ther Methods Clin Dev. 2021;23:87–97.