Crosslinking mass spectrometry (XL-MS) goes mainstream

Význam tématu

Crosslinking mass spectrometry (XL-MS) představuje moderní instrumentální přístup k zachycení protein-protein interakcí přímo v blízkosti přirozeného fyziologického stavu. Na rozdíl od rentgenové krystalografie, cryo-EM či NMR vyžaduje minimum materiálu, nevyžaduje extrémní čistotu vzorku a umožňuje studium jak pevných, tak vysoce přechodných komplexů. Díky prostorovým omezením vázacích reagentů vytváří vzdálenostní mapy vazebných míst a přispívá k pochopení funkčních mechanismů molekulárních strojů v buňce.

Cíle a přehled studie

Cílem bílého dokumentu je představit XL-MS jako plnohodnotný a standardizovaný workflow od vývoje MS-cleavable crosslinkerů (DSSO, DSBU), přes nové možnosti fragmentací (CID, HCD, ETD/EThcD) až po speciální software (XlinkX, Proteome Discoverer). Dokument demonstruje, jak překonat technické překážky ve vzorku, akvizici i analýze dat a ukazuje praktickou uplatnitelnost v proteomově širokých i cílených experimentech.

Použitá metodika

Workflow vychází z bottom-up proteomiky:

• In vivo i in vitro křížové vázání proteinů pomocí DSSO či DSBU
• Enzymatická digestace na peptidy
• Obohacení křížových peptidů (enrichment)
• Separační LC-MS akvizice s využitím MS2 a MSn (CID, HCD, ETD, EThcD)
• Quantitativní značení TMT a synchronní výběr fragmentů (SPS-MS3) pro přesnou kvantifikaci
• Data processing pomocí uzpůsobeného algoritmu XlinkX integrovaného do Proteome Discoverer

Použitá instrumentace

• Orbitrap Fusion Tribrid hmotový spektrometr
• MS-cleavable crosslinkery DSSO (disulfoxidový linker) a DSBU (dibuthyrický ureasový linker)
• Tandem Mass Tags (TMT) izobarické značky

Hlavní výsledky a diskuse

MS-cleavable linkery umožňují v MS2 generovat diagnostické fragmenty, které usnadňují odlišení křížových peptidů od nekřížových. Cílené MS3 sekvenování zvyšuje spolehlivost identifikací. Kombinované fragmentace ETD/EThcD navyšují pokrytí sekvence a zlepšují identifikaci obtížných vazeb. SPS-MS3 výrazně zlepšuje kvantitativní přesnost TMT experimentů a minimalizuje interference koeluujících iontů. Software XlinkX redukuje výpočetní složitost vyhledávání z n^2 na lineární růst, čímž zrychluje analýzu i zvyšuje výtěžnost identifikací.

Přínosy a praktické využití metody

• Mapování proteinových komplexů a interakcí v nanogramových množstvích
• Strukturální doplněk k high-resolution metodám (cryo-EM, X-ray, HDX-MS)
• Kvantitativní srovnání interakcí v různých fyziologických či patologických stavech
• Snadná implementace v každé proteomické laboratoři bez nutnosti speciálního vybavení

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší rozšíření multiplexních kvantitativních přístupů (QMIX) pro simultánní sledování více podmínek, integrace s dynamickými technikami (HDX, native MS) a aplikace v reálném čase pro mapování kompletního interaktomu. Další vývoj softwaru a automatizace workflow přispěje k praktickému využití v farmaceutickém výzkumu i rutinní QA/QC analytice.

Závěr

XL-MS dnes představuje mainstreamovou metodu pro studium protein-protein interakcí i strukturální dynamiky proteinových komplexů. Kombinace MS-cleavable reagentů, pokročilé fragmentační technologie a specializovaného softwaru umožňuje rychlou, citlivou a kvantitativní analýzu komplexních biologických vzorků v přirozeném stavu.

Reference

1. Kao A, Chiu CL, Vellucci D, Yang Y, Patel VR, Guan S, Randall A, Baldi P, Rychnovsky SD, Huang L. Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes. Mol Cell Proteomics. 2011;10(1):M110.002212.
2. Müller MQ, Dreiocker F, Ihling CH, Schäfer M, Sinz A. Cleavable cross-linker for protein structure analysis: reliable identification of cross-linking products by tandem MS. Anal Chem. 2010;82(16):6958–6968.
3. Yu C, Kandur W, Kao A, Rychnovsky S, Huang L. Developing new isotope-coded mass spectrometry-cleavable cross-linkers for elucidating protein structures. Anal Chem. 2014;86(4):2099–2106.
4. Yu C, Mao H, Novitsky EJ, Tang X, Rychnovsky SD, Zheng N, Huang L. Gln40 deamidation blocks structural reconfiguration and activation of SCF ubiquitin ligase complex by Nedd8. Nat Commun. 2015;6:10053.
5. Boutilier JM, Warden H, Doucette AA, Wentzell PD. Chromatographic behaviour of peptides following dimethylation with H2/D2-formaldehyde: implications for comparative proteomics. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2012;908:59–66.
6. Liu F, Rijkers DT, Post H, Heck AJ. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 2015;12(12):1179–1184.
7. Frese CK, Altelaar AF, van den Toorn H, Nolting D, Griep-Raming J, Heck AJ, Mohammed S. Toward full peptide sequence coverage by dual fragmentation combining electron-transfer and higher-energy collision dissociation tandem mass spectrometry. Anal Chem. 2012;84(22):9668–9673.
8. Frese CK, Zhou H, Taus T, Altelaar AF, Mechtler K, Heck AJ, Mohammed S. Unambiguous phosphosite localization using electron-transfer/higher-energy collision dissociation (EThcD). J Proteome Res. 2013;12(3):1520–1525.
9. Bomgarden R, Raja E, Etienne C, Liu F, Heck A, Müller M, Viner R. Optimization of crosslinked peptide analysis on an Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer. ASMS 2016 Poster.
10. Ting L, Rad R, Gygi SP, Haas W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 2011;8(11):937–940.
11. McAlister GC, Huttlin EL, Haas W, Ting L, Jedrychowski MP, Rogers JC, Kuhn K, Pike I, Grothe RA, Blethrow JD, Gygi SP. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 2012;84(17):7469–7478.
12. Yu C, Huszagh A, Viner R, Novitsky EJ, Rychnovsky SD, Huang L. Developing a multiplexed quantitative crosslinking mass spectrometry platform for comparative structural analysis of protein complexes. Anal Chem. 2016;88(20):10301–10308.
13. Liu F, Lössl P, Scheltema R, Viner R, Heck AJ. Optimized fragmentation schemes and data analysis strategies for proteome-wide cross-link identification. Nat Commun. 2017;8:15473.